Микроскопическая дифференцировка ооцист криптоспоридий и кислотоустойчивых микроорганизмов

Е. М. Ленченко, Е. М. Пирожкова
Московский государственный университет прикладной биотехнологии

МАТЕРИАЛЫ 16-го МОСКОВСКОГО МЕЖДУНАРОДНОГО ВЕТЕРИНАРНОГО КОНГЕССА ПО БОЛЕЗНЯМ МЕЛКИХ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ 

Охрана окружающей среды от биологической контаминации, в том числе и возбудителей инфекционных и паразитарных болезней, представляет социально-экономическую значимость, в связи с широким распространением зоонозов и зооантропонозов во всем мире, в том числе и Российской Федерации. В этих условиях, необходимым звеном исследований является разработка научно-обоснованных мероприятий по совершенствованию системы мониторинга за окружающей средой. В настоящее время с целью прижизненной диагностики возбудителей паразитарных и инфекционных болезней достаточно широко используются микроскопические методы исследования. Несмотря на очевидные преимущества во времени и технике выполнения, в ряде случаев могут возникать определенные сложности, например при обнаружении и дифференцировке ооцист криптоспоридий, кислотоустойчивых бактерий, дрожжей и дрожжеподобных грибов. В этой связи целью работы являлась сравнительная оценка и подбор чувствительных микроскопических методов дифференцировки ооцист криптоспоридий и кислотоустойчивых микроорганизмов.

В опытах использовали материал, полученный от цыплят – бройлеров. При подготовке препаратов на предметное стекло наносили 2 капли изотонического (0,9%) раствора хлорида натрия и помещали небольшое количество feces птиц, смешивали стеклянной палочкой до получения гомогенной массы и делали тонкий мазок, который высушивали на воздухе (30 мин). Крупные частицы удаляли скальпелем, мазок фиксировали в течение 15 мин смесью Никифорова (смесь равных частей эфира и 96° этилового спирта) и тщательно подсушивали на воздухе.

Для окрашивания карболовым фуксином по Циль—Нильсену мазок быстро проводили несколько раз над пламенем горелки. Затем мазок окрашивали раствором карболового фуксина 10 мин. Промывали мазок водопроводной водой, обесцвечивали 7 % раствором серной кислоты 50 с, затем опять промывали водой и подкрашивали в течение 5 мин 0,2% водным раствором метиленового синего. После этого опять промывали мазок в воде, тщательно высушивали на воздухе и исследовали под микроскопом с иммерсией. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округлых образований диаметром до 5 мкм. Даже при сходстве по размерам с каплями жироподобных веществ и гранулами детрита эти образования легко отличить от ооцист криптоспоридий по отсутствию у них отчетливой оболочки и какого-либо структурированного содержимого внутри. Преимущество метода в быстром приготовлении, без предварительной фиксации мазков, кроме того краска не выцветает в течение многих месяцев и препараты можно повторно исследовать.

При окраске раствором сафранина сначала обрабатывали мазок смесью Никифорова, затем высушивали на воздухе (при комнатной температуре) и фиксировали над пламенем горелки. Окрашивали раствором сафранина 5 мин (водный насыщенный раствор сафранина — 2 части, 5,6% раствор гидроокиси калия — 5 частей). После споласкивания водой мазок выдерживали 10 с в 0,1% растворе серной кислоты, затем промывали водой, и 10—15 с окрашивали в 5% растворе малахитового зеленого. Промывали мазок в воде, высушивали на воздухе, исследовали под микроскопом с иммерсией. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-розовый цвет и хорошо выделяются на зеленом фоне. Тогда как другие микроорганизмы не окрашиваются сафранином.

Для негативного окрашивания нигрозином небольшое количество feces птиц смешивали на предметном стекле с таким же объемом 1% водного раствора нигрозина до получения гомогенной и равномерно окрашенной суспензии. Мазок высушивали на воздухе и исследовали под микроскопом (Х40). Ооцисты криптоспоридий нигрозином не окрашиваются, имеют вид прозрачных круглых образований диаметром 5 мкм, оконтуренных снаружи отчетливым черным ободком, который облегчает их идентификацию. Однако эта краска нестабильна, препараты быстро выцветают и непригодны для длительного хранения. Негативное окрашивание нигрозином является одним из методов быстрого скрининга исследуемого материала.

Для сканирующей электронной микроскопии нами модифицирована методика подготовки препаратов, позволяющая выявлять по типичным признакам ооцист криптоспоридий и кислотоустойчивых микроорганизмов. Сущность методики заключается в использовании для фиксации Для исследований структуры ооцист криптосопиридий и микроорганизмов в сканирующем электронном микроскопе следует использовать фиксацию 1,0-3,0 % раствором глутарового альдегида в течение 72-96 ч. Это позволяет одновременно выявлять возбудителей паразитарных и инфекционных болезней, относящихся к разным систематическим группам, сохраняя естественную архитектонику сочленов микробиоценоза желудочно-кишечного тракта.

Результаты исследований и анализ данных литературы позволяет заключить, что апробированные методики характеризуются достаточной чувствительностью, препараты относительно быстро можно приготовить в условиях практических ветеринарных лабораторий. Для выявления и дифференцировки ооцист криптоспоридий и кислотоустойчивых микроорганизмов рекомендуем окраску карболовым фуксином по Циль-Нильсену, сафранином и негативное окрашивание нигрозином. В области познания общей патологии очевидна перспективность электронно-микроскопических исследований, способствующих раскрытию механизма адаптации возбудителей паразитарных и инфекционных болезней к длительной персистенции в теплокровном организме и окружающей среде.

Аннотация. Для выявления и дифференцировки ооцист криптоспоридий и кислотоустойчивых микроорганизмов (бактерий, простейших организмов, дрожжевых и дрожжеподобных грибов) достаточно точными и легко выполнимыми в практических ветеринарных лабораториях являются окраска сафранином, карболовым фуксином по Циль-Нильсену и метод негативного окрашивания нигрозином. Для исследований структуры ооцист криптосопиридий и микроорганизмов в сканирующем электронном микроскопе следует использовать фиксацию 1,0-3,0 % раствором глутарового альдегида в течение 72-96 ч.

Summary
Lencenko E.M., Pirogkova E.M. Differentiate oocysts chryptosporidia and acid-resisting microorganisms in the microscope. Moscow State University of Applied Biotechnology (MGUPB).

Safranine colouring, Ziel-Nielsen fuchsine colouring and the method of the negative nigrosine colouring are rather accurate and easy to reveal and differentiate oocysts chryptosporidia and acid-resisting microorganisms (bacteria, protozoa, yeast and yeast-like mushrooms) in practical veterinary labs. In order to examine thе stucture of oocysts chryprosporidia and microorganisms in the scanning electronic microscope one should use a 1,0-3,0% solution fixation of glutaraldehyde during 72-96 hours.