Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа при определении уровня антител к вирусу гриппа А кур
Кузнецов Д.П., Хашин О.В., Кузнецова С.В.
Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г.Щелково, Московской области
МАТЕРИАЛЫ 16-го МОСКОВСКОГО МЕЖДУНАРОДНОГО ВЕТЕРИНАРНОГО КОНГЕССА ПО БОЛЕЗНЯМ МЕЛКИХ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ
С целью оптимизации процесса постановки реакции, для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, необходимо подобрать концентрации используемых реагентов. Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:100.
Постановку непрямого ИФА проводили по следующей схеме. Двукратные разведения антигена, начиная с концентрации 50 мкг/мл в объеме 100мкл, адсорбировали в лунках полистирольных микропланшет в течение 18 ч при +40С, после чего микропланшеты пятикратно промывали ФБР, содержащем 0,1% Тритона Х-305, pН 7,2 - 7,4, и вносили по 100мкл положительной и отрицательной сыворотки в разведении 1:200. Микропланшеты помещали в термостат на 1 ч при +370С и промывали, как описано выше. На следующей стадии микропланшеты обрабатывали антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом в объеме 100мкл на лунку. Затем микропланшеты промывали. Реакцию проявляли субстратным раствором о-фенилендиамина 10 минут и учитывали после остановки 1М серной кислотой по показаниям ОП490 на считывающем устройстве "Sigma" (рис.1).
Оптимальное разведение антигена составило 1мкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (ОП490 равeн 1,8 - 1,6) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.
Рис.1. Определение оптимальной концентрации антигена вируса гриппа А кур для постановки ИФА.
Рис. 2. Определение оптимальной концентрации анти-гриппозной сыворотки кур для постановки ИФА.
Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП490 продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт проводили при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:50. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем в 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:200. При разведении ниже 1:100 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции (рис. 2).
Таким образом, была определена концентрация антигена вируса гриппа А кур и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для определения уровня антител иммуноферментным методом.
Summary
Kouznetzov D.P.,Нachin O.V., Kouznetzova S.V. The optimation of conditions resolve ELASA for determination of level antibodies of virus influenza birds. VNITIPB, Shelkovo, Moscow reg.
Were determination the concentration of antigen and positive whey for determination of level antibodies of virus influenza birds the ELASA.