Филогенетический анализ изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации

Плотников В.А., Гребенникова Т.В., Норкина С.Н., Дудникова Е.К., Алипер Т.И. НПП «АВИВАК», Москва НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ
Проведено исследование биологического материала, полученного от кур из различных птицеводческих хозяйств, расположенных на территории Московской, Ростовской, Липецкой и Свердловской областей. Наличие вируса было диагностировано методом ИФА для определения группоспецифического антигена р27 и методом ПЦР. Было выделено и исследовано 5 изолятов вируса лейкоза птиц. Проведен филогенгетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов env и установлено, что выделенные изоляты вируса лейкоза птиц относятся к различным генетическим группам штаммов ВЛП.

ВВЕДЕНИЕ
Вирус лейкоза птиц (ВЛП) является представителем лейкозно-саркомной группы (ЛСГ), которая относится к роду птичьих ретровирусов и подразделяется на 6 подгрупп: A, B, C, D, E и J. Подгруппы выделены на основании различий: в последовательностях гена вирусного оболочечного гликопротеина еnv; в моделях проникновения вируса в восприимчивый организм; в инфекционности вирусов для ряда «мишеней» (in vitro и in vivo). Вирусы подгрупп A, B, C, D, J являются экзогенными вирусами, а подгруппа E относится к эндогенным. Среди структурных полипептидов (р27, р19, р15, р12 и р10) присутствующих у всех членов лейкозно-саркоматозной группы ретровирусов, включая эндогенные и экзогенные ВЛП, превалирующим является р27. Факт наличия у эндогенных и экзогенных вирусов общего группоспецифического антигена р27 весьма затрудняет дифференциальную диагностику ВЛП с использованием методов, основанных на его выявлении.

Другие методы, включая молекулярные, не базирующиеся на детекции общего для эндогенных вирусов антигена, широко используются для подтверждения лейкозной инфекции в пораженных стадах птиц.

Экзогенные ВЛП способны индуцировать различные новообразования. Самым распространенным видом опухолей, вызываемых этой подгруппой вирусов является лимфоидный лейкоз (ЛЛ), или В-клеточная лимфома, первично образующаяся в фабрициевой сумке и инициирующая образование метастазов в висцеральных органах. В большинстве случаев от пораженных птиц выделяют вирус подгруппы А. Однако, подгруппа J, впервые описанная в Англии в 1989 году, а позже и в других странах, была первично выделена при заболевании миелоидным лейкозом (МЛ) мясных пород кур [5, 6].

Экзогенные ВЛП передаются как вертикально, так и горизонтально, при наличии полной инфекционности вируса. Эндогенные ВЛП обычно передаются генетически в зародышевых клетках обоих полов. Многие из них являются генетически дефективными. Именно поэтому они не могут привести к развитию инфекционных вирионов. Однако, некоторые из них могут экспрессироваться в инфекционную форму в эмбрионах или у вылупившихся птенцов [4].

Экономические потери от заболеваний, индуцированных ВЛП, приписывают двум основным причинам. Во-первых, непосредственно, общая смертность птиц составляет около 1 - 2%, а в совокупности со случайными потерями может доходить до 20% и более. Во-вторых, инфицирование ВЛП, которому подвергается большинство голов в птичьей стае, в виду высокой патогенности вируса, производит подавляющий эффект на некоторое число важных производственных показателей, включая продукцию яиц и их качество [3].

В связи с этим, диагностика заболевания и молекулярно-генетический анализ выявленных вирусных изолятов позволяют оценить эпизоотическую обстановку в птицеводческих хозяйствах и распространение различных штаммов ВЛП на территории страны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор образцов. Для выявления вирусных антигенов ВЛП биологические образцы после сбора при транспортировке были помещены на лед и, в дальнейшем хранились при -700 C. Для тестирования методом ИФА образцы хранились в фосфатном буферном растворе (PBS) содержащем 0,1% Tween 80. Для исследования методом ПЦР образцы хранились в замороженном состоянии без добавления дополнительных реагентов. Для анализа использовали цельную кровь, сыворотку, клоакальные смывы, альбумин, фрагменты новообразований и другие ткани.

Выделение вируса. Для исследования и выделения ВЛП отбирали пробы крови в гепаринизированные шприцы от птиц с клиническими признаками неопластических заболеваний. Пробы тестировали на наличие группоспецифического p27-антигена ВЛП методом иммуноферментного анализа (ИФА). Положительные пробы были в дальнейшем использованы для вирусовыделения.

Для выделения изолятов ВЛП использовали первичную культуру клеток фибробластов, полученную от 11-дневных СПФ куриных эмбрионов (Loghman, Германия). Изоляты инкубировали в течение 7-11 дней при температуре 370С в СО2-инкубаторе. В качестве контроля служили матрацы с неинокулированной культурой клеток куриных фибробластов.

Иммуноферментный анализ. Определение наличия вируса и подтверждение выделения вирусных изолятов проводили с использованием коммерческого ИФА-набора (АВИВАК, Россия) для определения группоспецифического антигена р27 по методике производителя. Выделение РНК: суммарную РНК выделяли из монослоя зараженных вирусом клеток с использованием тризола (Trizol, “Gibco BRL”, США) и с использованием коммерческого набора (ВЕТБИОХИМ, Москва), с использованием неорганического сорбента по методике производителей.

ОТ-ПЦР проводили в одной пробирке. Реакционная смесь содержала 1 мкл of РНК, 10 пмоль каждого праймера, 2.5 ед. of TaqI полимеразы (Gibco BRL, Grend Island), 2,5 ед. of MMLV обратной транскриптазы (Gibco BRL, Grend Island), 10 mM Tris-HCl, (pH 9.0 при 250C), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 1.5 mM MgCl2. Использовали следующие параметры ОТ-ПЦР: (50оС- 45 мин, 95оС – 5 мин) - 1 цикл , ; (950С – 1 мин, 510С - 1 мин, 720С – 1 мин.) - 5 циклов; (950С – 30 сек, 510С - 30 сек, 720С – 45 сек) - 30 циклов.

Праймеры. Для индикации генома вируса лейкоза птиц в ПЦР использовались праймеры от тест-системы обнаружение вируса ВЛП («ВЕТБИОХИМ», Россия).

Секвенирование. Продукты ПЦР были очищены в геле, используя набор для очистки продуктов ПЦР из геля (Geneclean) и секвенированы. Определение первичной последовательности проводили на автоматическом ДНК секвенаторе (ABI 377, США) и анализировали с использованием компьютерных программ MacVector/AssemblyLign (Oxford Molecular Group, США) и PHYLIP (Felsenstein, 1993).

Р ЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В представленном исследовании провели комплексную работу по сбору и анализу полевого материала ряда из птицеводческих хозяйств Российской Федерации. 126 объединенных проб крови из 20 птицеводческих хозяйств различных регионов Российской федерации были исследованы на наличие вируса лейкоза птиц.

Выделенная из проб крови плазменная фракция использовалась для изоляции вирусов в культуре клеток СПФ ФЭК, с целью создания банка вирусных изолятов и изучения культуральных свойств и молекулярно-генетической характеризации.

Пробы крови были протестированы на наличие группоспецифического p27-антигена ВЛП методом иммуноферментного анализа. В результате проведённых исследований выявлено 6% положительных образцов. Наличие вируса было выявлено в 7 птицеводческих хозяйств. При этом в некоторых хозяйствах все отобранные пробы были положительными (100%) [2].

Для выделения изолятов вируса лейкоза птиц было проведено несколько пассажей на культуре клеток куриных фибробластов. После 7-11 дней культивирования наличие изолятов проверяли при помощи методов ПЦР и ИФА.

Выделенные изоляты и их обозначение представлены в таблице 1.

Для выявления генома вируса лейкоза птиц из проб крови и инокулированных культур клеток была выделена РНК, которую использовали для ПЦР. В результате амплификации с праймерами для лейкоза A-D синтезировали вирусспецифический фрагмент кДНК размером 314 п.н. и 738 п.н. – в результате амплификации с праймерами для лейкоза J. Данные праймеры были разработаны ранее и использованы для исследования на наличие вируса лейкоза [1].

Определение и сравнительный анализ структуры амплифицированных фрагментов ДНК показал, что все исследованные пробы содержали фрагменты генома полевых изолятов вируса лейкоза птиц.

Таблица 1. Изоляты ВЛП, выделенные на территории РФ.

Для выявления генетических отличий у полученных нами изолятов ВЛП был проведен анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного ПЦР-фрагмента гена env.  Нуклеотидные последовательности выделенных ранее вирусов лейкоза птиц получали из банка данных GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Необходимо отметить, что молекулярно-генетическое исследование различных подтипов вируса лейкоза птиц получило широкое распространение в последние годы [7], [8].

При проведении филогенетических исследований важным является вопрос о выборе участка генома, на основании которого проводится анализ. Мы выбрали участок гена env, поскольку основные подгруппы вируса лейкоза птиц выделены на основании различий в последовательностях гена вирусного оболочечного гликопротеина env, что определяет различное поведение в реакции нейтрализации, различие в моделях проникновения вируса в восприимчивый организм и различие в инфекционности вирусов для ряда мишеней (in vivo и in vitro).

На рисунке 1 представлена филогенетическая дендрограмма, построенная на основании частичных последовательностей гена envelope вируса лейкоза птиц.

Рисунок 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных оследовательностей фрагмента гена env (314-738 н.) штаммов и изолятов из базы данных GenBank (филогенетическая дендрограмма).

Анализ филогенетической дендограммы (рисунок 1) показал, что изолят 130 образует с известными ранее изолятами (AY013303, EF467236, DQ500007, AY013304, EU070900, EU070901, EU070902, M37980, NC_001408, DQ365814, AY350569, AB303223, AB112960) одну генетическую группу, с уровнем внутригрупповых отличий не превышающих 6%. В данной группе представлены эндогенные и рекобинантные ВЛП, выделенные на территориях США, Китая, Франции и Японии.

Изоляты 138 и 346 образуют одну генетическую группу с изолятами ВЛП подгруппы J, выделенных на территории Китая и Франции. Внутригрупповые отличия в данной группе не превышают 5%.

Остальные выявленные изоляты формировали собственную отдельную генетическую группу. Планируется продолжение исследований по выделению и характеризации изолятов вируса лейкоза птиц из различных регионов Российской Федерации.

Суммируя полученные результаты, необходимо отметить, что были выделены 5 изолятов вируса лейкоза птиц в первичной культуре клеток куриных фибробластов. Изоляты были идентифицированы методами ИФА и ПЦР. Также было установлено, что выделенные отечественные изоляты ВЛП отличаются от изолятов, выделенных на территории других стран. Исследуемые изоляты формируют три группы, в две из которых входят как российские изоляты (130, 346 и 138), так и изоляты других стран. Изоляты 132 и 76 образуют отдельную генетическую группу.

Литература
1. Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Власова А. Н., Покровская М. А., Богосьян А. А., Забережный А. Д., Алипер Т. И. Непоклонов Е. А.- Исследование поголовья птиц на наличие вируса птичьего лейкоза методом ПЦР.// Птицы и птицепродукты. 2003. – 6. – c. 35-37.
2. Плотников В.А., Алипер Т. И., Дудникова Е.К., Норкина С.Н., Гребенникова Т. В.. Распространение вируса лейкоза птиц на территории Российской Федерации. 10-й Междунар. Конгр. «Здоровье и образование в XXI веке» Инновационные технологии в биологии и медицине», РУДН, 2009
3. Aly M. Fadly. Isolation and identification of avian leukosis viruses: a review. Avian Path, 2000, 29, 529-535
4. A.R. Pandir, I.M. Gimeno, W.M. Reed, L.F. Lee, R.F. Silva and A.M. Fadly. Distribution of viral antigen gp85 and provirus in various tissues from commercial meat-type and experimental White Leghorn Line 0 chikens with different subgroup J avian leukosis infection profiles. Avian Path, Feb 2008, 37(1), 7-13.
5. Arun R. Pandiri, Jody K.Mays, and Aly M. Fadly. Influeceof Strain, Dose, of Virus, and Age of Inoculation on Subgroup J Avian Leukosis Virus Persistence, Antibody Response, and Oncogenicity in Commercial Meat-Type Chikens. Avian Dis., 2007, 51, 725-732,.
6. Fadly, A.M., and L.N.Payne. 2003. Leukosis/sarcoma group, p. 465-516. In Y.M.Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDougald, and D.E. Swayne (ed.), Diseases of Poultry, 11th ed, Iowa State Press, Ames.
7. Thapa BR, Omar AR, Arshad SS, Hair-Bejo M. Detection of avian leukosis virus subgroup J in chicken flocks from Malaysia and their molecular characterization. Avian Pathol. 2004 Jun;33(3):359-63.
8. Zavala G, Cheng S, Jackwood M. W. Molecular epidemiology of avian leukosis virus subgroup J and evolutionary history of its 3 untranslated region. Avian Dis. 2007 Dec; 51(4):942-53.

Подготовлено по материалам «VIого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com