К вопросу разработки технологии производства и контроля вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма «к-58»

А.В.Борисов, Ю.В.Кузнецов, В.Н.Кузнецов

РЕЗЮМЕ

В статье представлены материалы, касающиеся разработки технологии производства и контроля вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) из штамма «К-58».

ВВЕДЕНИЕ
Инфекционная бурсальная болезнь птиц (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) – высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят, преимущественно в возрасте 15–80 суток, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. Вирус ИББ поражает, в основном, β-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию её лимфоидных фолликулов.

ИББ птиц зарегистрирована во всех странах мира. Экономический ущерб от ИББ значителен и обусловлен гибелью до 20–70% поголовья цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, возникновением вторичных инфекций.

Известной особенностью возбудителя ИББ птиц является его антигенная изменчивость в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки и на разных территориях и зависящая от видового и породного состава птичьего поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Поэтому, чтобы обеспечить высокую эффективность применяемых вакцинных препаратов, выбор вакцинного штамма вируса ИББ птиц необходимо проводить с учётом антигенной структуры эпизоотического изолята, а для приготовления вакцин использовать производственные штаммы, обладающие наибольшей степенью гомологии в области антигенной детерминанты с эпизоотическими изолятами вируса ИББ.

Общепризнанный факт, что вакцинопрофилактика – единственно правильное и надёжное направление в борьбе с данной инфекцией. Для специфической профилактики ИББ птиц используются живые и инактивированные вакцины из гомологичных штаммов возбудителя инфекции, репродуцированного в различных чувствительных биологических системах. К преимуществам живых вакцин против ИББ птиц следует отнести их низкую себестоимость, высокие эксплуатационные свойства, способность формировать высокий уровень напряжённости иммунитета на более длительный срок (1).

В настоящее время известен ряд вирусвакцин против ИББ птиц, полученных в чувствительных биологических системах и содержащих вирусный материал из гомологичных возбудителю штаммов: «Винтерфилд-2512» (2, 3, 4); «ВНИВИП» (5); «КБК» (6, 7); «Био-92» (8). Однако, общим недостатком известных вирусвакцин против ИББ птиц является их низкая антигенная и иммуногенная активность.

Наиболее эффективной среди используемых в настоящее время живых вакцинных препаратов, является вирусвакцина против ИББ птиц, содержащая вирусный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «БГ», полученного в 9–11- суточных эмбрионах SPF-кур (9). По своей антигенной и иммуногенной активности вирусвакцина из штамма «БГ» превосходит все известные аналогичные биопрепараты, применяемые на территории Российской Федерации и стран СНГ. О высокой эффективности и надёжности данного препарата свидетельствует то, что за 15 лет использования живых и инактивированных вакцин он занял лидирующее место по результатам коммерческой реализации среди вакцин против ИББ.

Однако, данная вирусвакцина имеет недостаток, состоящий в том, что она индуцирует редукцию бурсы и незначительную иммунодепрессию.

Проведённые ранее исследования по сравнительной оценке иммунобиологических свойств штаммов «БГ» и «К-58» вируса ИББ птиц показали, что штамм «К-58», полученный сотрудниками лаборатории респираторных вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ», обладает, по сравнению со штаммом «БГ» вируса ИББ птиц, более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Это свидетельствует о более высокой эффективности штамма «К-58» и позволяет рассматривать его в качестве штамма, пригодного для изготовления высокоспецифического, чувствительного, высокоиммунного и безвредного препарата (10).

Поэтому цель настоящего исследования – получить безвредную вирусвакцину против ИББ птиц, обладающую высокой антигенной и иммуногенной активностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штамм «К-58» вируса ИББ птиц (10).

Предварительно проверенной на инфекционную активность, отсутствие контаминации микоплазмами и посторонними вирусами, матровой расплодкой инокулировали 9-11-суточные эмбрионы СПФ-кур следующим образом. На границе подскорлупной оболочки и хориоаллантоисной оболочки делали насечку, не повреждая ее, и затем с помощью шприца вводили вирусосодержащий материал на ХАО в количестве 0,2 см3. Отверстие в скорлупе заклеивали лейкопластырем.

Инфицированные эмбрионы инкубировали при температуре 37,5оС в течение 48-120 ч. После 48 часов овоскопию проводили через каждые 3 часа и отбирали павшие эмбрионы, которые разделывали и замораживали при температуре минус 60оС.

Полученный вирусосодержащий материал размораживали, измельчали, экстрагировали при 4оС в течение 45 мин, дважды промораживали-оттаивали, добавляли фосфатный буферный раствор, рН 7,6 и центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин.

Полученную вирусосодержащую суспензию после добавления стабилизаторов расфасовывали по 4,0 см3 в стерильные флаконы, промораживали при температуре минус 70оС необходимое время и подвергали лиофилизации. Лиофилизованный материал закупоривали под вакуумом и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Сухую вирусвакцину хранили при положительной температуре (6±2оС).

Инфекционную активность определяли титрованием на 10-суточных эмбрионах СПФ-кур. Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации И.П.Ашмарина (11).

Иммуногенную активность вакцины определяли следующим образом. В опытах использовали цыплят 14-суточного возраста. Иммунизацию проводили двукратно методом выпаивания с водой с интервалом 10 суток. Через 14 суток после второй вакцинации отбирали пробы крови, получали сыворотки и исследовали их методом ИФА на наличие антител против ИББ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ
В результате проведённых исследований была разработана технология производства и контроля живой вирусвакцины против ИББ птиц из штамма «К-58»: подобраны оптимальные условия наработки вирусного материала, приготовления вируссодержащего сырья для вакцины; подобраны стабилизаторы, оптимальный компонентный состав (мас.%) вакцины; условия лиофилизации и хранения вирусвакцины (12).

Чтобы определить иммуногенную активность и уточнить дозы вирусвакцины против ИББ птиц из штамма «К-58», была проведена её раститровка с последующим контрольным заражением вирулентным штаммом ВIA 52/70. Результаты опытов представлены в табл. 1.
Таблица 1 Иммуногенная активность вирусвакцины против ИББ из штамма «К-58»

Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что вирусвакцина, разведенная в 1000 раз защищает всех птиц при контрольном заражении. Следует отметить, что выпаивание вакцины с водой является быстрым, дешевым, нетрудоёмким и эффективным способом массовой иммунизации птиц. Результаты проведённых исследований также показали, что десятикратная доза указанной вирусвакцины является безвредной, так как во время 10-суточного наблюдения отсутствовали клинические признаки и при вскрытии не обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для ИББ.

Проведены исследования иммунобиологических свойств вирусвакцины до и после длительного хранения.

В исходных и хранившихся в течение 6 и 12 месяцев при положительной температуре (6±2°С) образцах вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58» была определена инфекционная и иммуногенная активность. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Таблица 2 Оценка иммунобиологических свойств вакцины против ИББ птиц из штамма «К-58» при различных сроках её хранения

Результаты проведённых исследований показали, что иммуногенная активность вирусвакцины против ИББ птиц из штамма «К-58», хранившейся при положительной температуре (6±2оС) в течение как шести, так и двенадцати месяцев (срок наблюдения), по сравнению с исходной иммуногенной активностью, не снижалась.

К настоящему времени изготовлены три производственные серии вакцины против ИББ из штамма «К-58» и исследованы в лабораторных условиях.

Результаты контроля представлены в табл. 3.

Таблица 3 Иммунобиологические свойства промышленных серий вакцин против ИББ из штамма «К-58»

Исходя из данных, представленных в табл. 3, можно утверждать, что вакцина против ИББ из штамма «К-58» иммуногена, безвредна и соответствует всем требованиям, предъявляемым к живым вакцинным препаратам.

ВЫВОДЫ
Разработанная в результате проведённых исследований вирусвакцина из штамма «К-58» против инфекционной бурсальной болезни птиц, обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, не вызывает иммуносупрессии и расширяет арсенал вирусвакцин против ИББ птиц, обеспечивающих эффективную защиту поголовья птиц от возбудителя ИББ.

Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Сюрин В.Н. и соавт. Вирусные болезни животных.– М., ВНИТИБП, 1998, 65–84.
2. Winterfild R.W. Immunity response to the infectious bursal agent //Avian Dis., 1969, 13, 548–557.
3. Winterfild R.W. et al. Immune response and pathogenecity of different strain of infectious bursal disease virus applied as vaccines//Avian Dis., 1978, 22, 4, 721–731. 4. Winterfild R.W. et al. Characteristics of apparent derivates of the 2512 strain of infectious bursal disease virus when used as vaccines//Avian Dis., 1981, 25, 4, 900–910.
5. Авт. свид. СССР № 1824443, С 12 N 7/00, А 61 К 39/12, 30.06.93г.
6. Пат. РФ № 2054038, С 12 N 7/00, 10.02.96г.
7. Пат. РФ № 2205021; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 27.05.03г.
8. Пат. РФ № 2191825; А61 К 39/12, С 12 N 7/00; 27.10.02г.
9. Пат. РФ № 2127602; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 20.03.99г.
10. Пат. РФ № 2268936; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 27.01.06г.
11. Пат. РФ № 2272649; А 61 К 39/12, С 12 N 7/00; 27.03.06г.
12. Ашмарин И.П., Воробьёв А.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях. – Л.: Медгиз, – 1962. – 180 с.

Подготовлено по материалам «Vого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com