Создание средств индикации и идентификации высокопатогенных вирусов гриппа А
А.П. Герилович – к. в. н., с.н.с.; Б.Т. Стегний – д. в. н., профессор, академик УААН; С.И. Симоненко – ветеринарный врач Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», г. Харьков, Украина
Статья посвящена разработке средств индикации высокопатогенного гриппа и ньюкаслской болезни, а также идентификации изолятов N1-, Н5– и Н7-субтипов.
На основе проведенного анализа предложены праймеры и разработаны методики выявления РНК вируса гриппа А (по М-гену), вируса высокопатогенного гриппа птицы субтипа H5N1 путем детекции участков генов ГА и НА, созданию протокола идентификации высокопатогенных вариантов субтипа Н7 вируса гриппа А,вируса ньюкаслской болезни путем амплификации высоковариабельного участка гена F, Разработанные методики оказались эффективными как при исследовании референтных, так и полевых образцов.
Грипп птицы (чума птицы) и ньюкаслская болезнь (псевдочума птицы) являются наиболее контагиозными и впечатляющими по размерам экономических потерь вирусных заболеваний многочисленных видов домашней и дикой птицы всех видовых групп.
На протяжении последних пяти лет панзоотия гриппа птиц охватила почти весь Евроазиатский континент. Сложившаяся эпизоотологическая опасность обусловлена циркуляцией высокопатогенных вариантов гриппа птицы субтипов Н5N1 и Н7N3. Вследствие высокой вариабельности геномной РНК вируса существует вероятность быстротечной изменчивости и рекомбинации, что приводит к вариабельности антигенной структуры возбудителя и снижению эффективности применения вакцинных препаратов из штаммов, которые были изолированы в предыдущие годы.
Учеными разных стран отмечено наличие нескольких групп изолятов, отличающихся по нуклеотидному составу генов гемагглютинина, нейраминидазы и главного вирусного тегумента [1, 2]. Распределение изолятов на соответствующие субтаксоны в соответствии с качественным составом их генетического материала позволяет, во-первых, получить представление об экологических взаимоотношениях в системе вирус-хозяин для изучения путей миграции переносчиков вируса и прогнозирование эпизоотологической ситуации, во-вторых, эффективно конструировать молекулярно- генетические тест-системы для индикации и идентификации РНК возбудителя, в-третьих, создать стратегию мер борьбы с заболеванием и ликвидации эпизоотологических очагов [3].
Цель работы. Создание системы методик по выявлению РНК вирусов гриппа А субтипа Н5N1, разработка протокола идентификации высокопатогенных вариантов вируса гриппа А субтипа Н7 на основе ПЦР-анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Для проведения исследований было использовано инактивированные формалином и β-пропиолактоном образцы эмбриональной расплодки штаммов Influenza A virus/курица/ Сиваш/02/2005/Н5N1 и Influenza A virus/курица/ Приморский/01/2006/ Н5N1 высокопатогенного вируса гриппа птиц, изолированных во время вспышек болезни среди кур в АР Крым, образцы эмбрион-адаптированного вируса – антиген вакцины «АвиФлуВак-ИЭКВМ» с титром не ниже 9 log2 в реакции гемагглютинации, а также образцы вируса гриппа субтипа Н7 (Н7N1 S.021 Польша 2007), вируса гриппа А субтипов Н1-Н6, Н8-Н14 и вирусы ньюкаслской болезни штаммов LaSota и ЛГ-85. Для проверки специфичности методик были использованы образцы кДНК референтных штаммов вируса гриппа А (Н1, Н2, Н4, Н5 (N1 и N3), Н7, Н10) и В, а также болезни Гамборо из коллекции отдела изучения болезней птицы ННЦ «ИЭКВМ».
В режиме on-line из международных баз данных EMBL, DDBJ и GenBank были получены полностью секвенированные последовательности изолятов вируса гриппа А субтипов Н5 и Н7 генов ГА, НА и М.
Множественное выравнивание последовательностей, показатели энтропии участков, характер замен и поиск консервативных регионов осуществляли при помощи программы BioEdit v.5.2.9 и ее модуля ClustalW.
Консервативные участки, обнаруженные при анализе структуры генов М, гемагглютинина, нейраминидазы вируса гриппа А анализировали при помощи программы AmplyfX v.1.1.2 с целью определения возможных праймерных пар. Оптимизация амплификационных термоциклов проведена с использованием программ пакета OLYGOSoft.
Экстракцию вирусной РНК проводили с помощью коммерческого набора «Рибосорб-50» производства Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии (Россия). Выделенные образцы РНК были использованы в качестве матрицы для синтеза кДНК. Реакцию обратной транскрипции (РОТ) проводили при помощи ревертазы производства фирмы Fermentas (Латвия) и набора «Реверта-L» производства Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии» (Россия).
Температурные режимы амплификации фрагментов генов, а также концентрации ионов магния, полимеразы, дНТФ, общий объем реакционной смеси оптимизировали с использованием базовых наборов «АмплиСенс К-200» Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии» (Россия) и Мастер-Микса производства фирмы Fermentas (Латвия).
Проверка чувствительности и специфичности методик была проведена с использованием гетерологических по гемагглютинину и нейраминидазе штаммов вируса гриппа А, а также образцов биомассы РНК-содержащих вирусов птицы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. При помощи программы BioEdit были изучены степени родства и вариабельности секвенированных последовательностей генов ГА и НА подтипов H5, H7, N1 вируса гриппа.
Выявленные консервативные участки генов ГА и НА висура субтипа H5N1 были проанализированы с целью подбора праймерных пар. С помощью программы для дизайна праймеров AmplyfX v.1.1.2 первоначально было выбрано для амплификации фрагментов гена ГА и НА 18 и 12 возможных праймерных пар, соответственно. На следующем этапе анализа было выбрано по четыре пары праймеров, которые имели ПЦР-quality 80–100 % (не образуют димеров, шпилек, характеризующихся содержанием GC-пар на уровне 50%).
В результате проверки специфичности in silico установлено, что амплификация со всеми специфическими последовательностями возможна при использовании лишь трех пар (Aiv H5 (1 и 2) и Aiv N1), фланкирующих участки гена ГА и НА длиною 487 п.н. и 425 п.н., соответственно.
Для проведения амплификации с использованием разработанных праймеров AivН5 проб суммарной кДНК гетерогенных контролей (суммарная кДНК, выделенная из куриных эмбрионов, инфицированных штаммом LaSota вируса ньюкаслской болезни, УМ-93 вируса болезни Гамборо и вирусами гриппа других субтипов, которые входят в состав «Гриппозной вакцины») образования специфических продуктов реакции не происходило.
После лабораторного испытания методики на ее основе создана «Тест-систему для обнаружения РНК высокопатогенного вируса гриппа птицы» (ТУ У 24.4-00497087- 060:2007).
В ходе производственных испытаний установлено наличие специфичных полос на электрофореграмме в трех заведомо положительных пробах экстраэмбриональной жидкости с разной активностью и в треке позитивного контрольного образца. Пробы кДНК из материала от интактных эмбрионов и гетерогенных контролей (вирусы гриппа Н1-4, Н6-14) после амплификации не образовали полос ампликона (рис. 1).
Электрофореграмма результатов ПЦР: М – маркер молекулярного веса; К+ – положительный контроль; К– – отрицательный контроль; 1 – ЭЭЖ интактных куриных эмбрионов; 2 – расплодка штамма А/курка/ Сиваш/02/06/Н5N1 в разведениях 1:16, 10 – 1:256 и 11 – 1:512; 3-8 – гетерологичный по нейраминидазе штамм вируса гриппа А А/крачка/Южная Африка/61/Н5N3, гетерологичные гемагглютинину и нейраминидазе штаммы вируса гриппа А (образцы экстраэмбриональной жидкости от инфицированных куриных эмбрионов): А/качка/Альберта/06/70/Н12N5, А/курка/Россия/5/87/Н7N1, А/свинья/Айова/Н1N1, А/курка/Германия/N/49/Н10N7, А/качка/Чехия/56/Н4N6; 7 – вирус ньюкаслской болезни; 12 – вирус болезни Гамборо.
Исследования специфичности системы разработанных праймеров, фланкирующих 425 п.н. фрагмент гена нейраминидазы показали, что пробы суммарной кДНК гетерогенных контролей (суммарная кДНК от куриных эмбрионов, инфицированных штаммов LaSota вируса ньюкаслской болезни, УМ-93 вируса болезни Гамборо и вируса гриппа других субтипов, которые входят в состав «Гриппозной вакцины») также не образовывали полос на електофореграмме после реакции.
С целью дизайна специфических праймеров для индикации вируса гриппа А были проанализированы 28 последовательностей гена М выбранного в качестве мишени. Полученные праймеры, названные IV_A_M_f и r, фланкирующие участок длиной 560 п.н., оказались специфичными по отношению к кДНК вируса гриппа А 7 субтипов (Н1, Н2, Н4, Н5 (N1 и N3), Н7, Н10. Специфичность праймерной системы и разработанной на ее основе методики доказана выявлением участка кДНК расчетной длины в образцах 7 подтипов вируса гриппа А и его отсутствием в образцах генетического материала вируса гриппа В, а также ньюкаслской болезни и инфекционной бурсальной болезни.
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина вируса гриппа Н7 был проведен на локальной базе данных, загруженной с Gen Bank при помощи менеджера последовательностей BioEdit, которая состояла из 24 элементов.
Обращая внимание на отсутствие общеконсервативных локусов для вируса гриппа Н7 Американского и Европейского генотипов, которые разрешали бы проводить одновременную индикацию обоих генотипов, было принято решение проводить расчет праймеров отдельно для каждого из них.
При анализе уровней энтропии в последовательностях гена Европейских (итальянского, немецких и английских) изолятов возбудителя было выявлено 9 общеконсервативных участков для этой группы. Их длина находилась в пределах от 22 п.н. до 48 п.н. В тоже время анализ американских и канадских изорлятов показал наличие 13 таких участков длиной 167 п.н.
Инструментальный анализ определенных консервативных регионов позволил выявить потенциальных 12 пар праймеров для детекции Европейских вариантов вируса гриппа А и 16 пар для выявления Американских изолятов. С учетом термодинамических характеристик и вероятности образования вторичных структур это количество составило 6 и 5 пар праймеров, соответственно.
На основе результатов углубленного анализа при помощи FASTA on-line установлена пригодность для практического использования 4 праймерных пар для Европейских вариантов и 2 альтернативных вариантов праймеров для детекции вируса Н7-субтипа, Американского генотипа, из числа котовых в дальнейшем выбрано две пары AivH7 (Eu) и AivH7 (Am), которые фланкировали фрагменты длиной 620 п.н. и 230 п.н.
На основе полученных результатов была разработана методика выявления РНК Европейского генотипа высокопатогенного гриппа птиц субтипа Н7 при помощи полимеразной цепной реакции.
Исследования относительно разработки методики с использованием видоспецифичных праймеров AivH7 (Eu) к Европейскому генотипу показали, что температура их отжига, которая обеспечивает специфическую детекцию РНК возбудителя (с образованием ампликона длиной 641 п.н.), составляет 54°С. Концентрация ионов магния в смеси, которая обеспечивала максимальную контрастность ампликона, составляла 1,5 мМ/мкл.
Для определения специфичности методики было использовано 10 положительных проб вируса гриппа Европейского генотипа и 5 – отрицательных.
Для контроля внутривидовой специфичности способа использовали образцы кДНК вируса гриппа субтипов Н1-Н14.
После амплификации на електрофореграмме установлено наличие специфических полос длиной 641 п.н. разной интенсивности во всех 10 пробах Европейского генотипа, а также в треке положительного контрольного образца кДНК вируса гриппа птиц субтипа Н7. В треках с отрицательными и гетерологичными пробами продуктов амплификации не выявлено.
Для определения чувствительности способа были использованы пробы суммарной кДНК в разведениях от 1:10 до 1:10000. Установлено, что благодаря использованию специфичных праймеров AivH7 (Eu) можно выявлять РНК высокопатогенного гриппа птиц Европейского генотипа субтипа Н7 в разведениях до 1:10000, что соответствует активности вируса 0,2 log2/мл.
Разработанные методики были апробированы на 250 образцах клинического материала от дикой и домашней птицы, в результате чего выявлено 15 позитивных образцов относительно гриппа А, 7 – относительно субтипа Н5N1 , 3 – относительно Н7N3.
ВЫВОДЫ
1. Рассчитаны праймеры AivH5, AivN1, IV-A-M, характеризующиеся высокими показателями ПЦР-quality и фланкируют высоковариабельные участки гена ГА, НА и М вируса гриппа длиной 487, 425 и 560 п.н., соответственно, которые рекомендовано использовать для диагностики гриппа и идентификации изолятов N1– и Н5-субтипов.
2. Разработана методика выявления РНК Европейского генотипа высокопатогенного гриппа птиц субтипа Н7 за счет использования видоспецифичных праймеров Aiv H7 (Eu) к Европейскому генотипу и оптимизированных параметров реакции, что обеспечивает образование специфичного ампликона длиной 641 п.н. Разработанная методика имеет высокую внутривидовую специфичность в отношении вируса гриппа А гетерологичных субтипов, вируса ньюкаслской болезни и геномного материала кур.
3. Апробация методик на образцах генетического материала гомологичных и гетерологичных вирусов птицы показала высокую специфичность предложенных методик. При исследовании 250 образцов клинического материала от дикой и домашней птицы была идентифицирована РНК вируса гриппа А – в 15 образцах, в т.ч. субтипа Н5 – в 7, Н7 – в 3.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Lee C.W., Suarez D.L. Avian influenza virus: prospects for prevention and control by vaccination//Anim Health Res Rev. – 2005. – P: 1–15.
2. Kida H., Ito T., Yasuda J. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs//J Gen Virol. – 1994. – Vol. 75. – P: 2183–2188.
3. Highly pathogenic avian influenza// O.I.E. Manual standards for diagnostics test and vaccines, adopted 05.2005.
Подготовлено по материалам «Vого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com