Изучение нуклеотидной последовательности вариабельной области гена F и филогенетический анализ вируса ньюкаслской болезни

Б.Т. Стегний ,А.П. Герилович, Д.В. Музыка Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» , Украина)

Ньюкаслская болезнь – это вирусное высококонтагиозное заболевание многих видов сельскохозяйственных и диких видов птицы, имеющее тенденцию к панзоотическому распространению и сопровождающееся различными формами течения.

Возбудитель заболевания – вирус ньюкаслской болезни (ВБН, парамиксовирус птиц типа 1) в соответствии с современной классификацией является таксоном рода Avulavirus, подсемейства Paramyxovirinae, семейства Paramyxoviridae, порядка Mononegavirales [1, 2].

По степени патогенности вируса выделяют четыре группы: велогенные висцеротропные, велогенные нейротропные, мезогенные и лентогенные варианты [3, 4, 5].

В настоящее время с позиций эпизоотологической характеристики возбудителя ученые уделяют большое внимание изучению его генетических особенностей вируса. Геном вируса ньюкаслской болезни имеет в своей структуре 6 генов. Наиболее вариабельным и показательным с точки зрения молекулярно-эпизоотологического исследования является ген F. Согласно анализу его нуклеотидной последовательности Aldous E. и соавт. описали 6 генотипов вируса НБ. Они охарактеризованы благодаря различиям в структуре указанного гена в области вариабельного участка длиной 340 п.н. [1].

Однако, кроме указанной области имеются и другие перспективные для анализа участки гена. При проведении анализа множественных выравниваний гена F нами установлено наличие других вариабельных областей, анализ последовательности которых мог бы быть показательным.

В связи с этим нами проведено секвенирование 512 п.н. участка, частично перекрывающегося с генотипоспецифической областью с 3’-конца.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
В работе использованы изоляты вируса НБ, выделенные на территории Украины в период с 1993 по 2007 гг. в виде экстраэмбриональной жидкости от инфицированных куриных эмбрионов: NDV/Dnipro/2007, NDV/WB/19/2006, NDV/WB/22/2007, NDV/Taranivka/93 и NDV/Muscovy duck/2005.

Экстракцию РНК проводили с использованием коммерческих наборов «Рибосорб» производства фирмы «ИнтерЛабСервис» (ФГУН ЦНИИЭ РосПотребНадзора, РФ), основанных на методе аффинной сорбции. Комплиментарную ДНК получали методом обратной транскрипции на РНК-матрицах с помощью коммерческих наборов для обратной транскрипции «Реверта-L» производства фирмы «ИнтерЛабСервис» (ФГУН ЦНИИЭ РосПотребНадзора, РФ).

Амплификацию анализируемой области осуществляли с использованием праймерных систем NDV Fusion и NDV_F2, разработки ННЦ «ИЭКВМ» и коммерческих реактивов Fermentas (Латвия).

Очистку амплифицированных фрагментов, химический сиквенс и оценку продуктов проводили с использованием реагентов и оборудования Applied Biosystems (США).

Хроматограммы сиквенса редактировали в менеджере нуклеотидных последовательностей BioEdit (v 7.1.1.5). Анализ последовательностей был проведен методами Neighbor Joining и Minimum Evolution с помощью программы Mega 4. Полученные в ходе сиквенса последовательности сравнивали с гомологичными участками генома ВБН, выделенных в различных регионах мира, опубликованными в GenBank.

На первичном этапе наших исследований были амплифицированы участки гена F вируса ньюкаслской болезни длиной 345 п.н. В результате реакции была установлена аутентичность изолятов вируса НБ NDV/Dnipro/2007, NDV/WB/19/2006, NDV/ WB/22/2007, NDV/Taranivka/93 и NDV/Muscovy duck/2005.

После наработки вторых фрагментов длиной 218 п.н. были также получены положительные результаты, что с одной стороны позволило с уверенностью говорить об аутентичногсти исследуемых вирусов, а с другой – наработать фрагмент гена F общей длиной 512 п.н.

После сиквенса, корректирования и совмещения полученных последовательностей нами было проведено их множественное выравнивание, в результате которого было идентифицировано три секувара вируса НБ по структуре исследуемой области генома.

Установлено принадлежность одного из изолятов вируса к секувару, подобному по структуре последовательности изоляту Belgium (выделен в Бельгии в 2004 г.). На анализируемом участке гена F, было обнаружено от 0 до 6 замен по отношению к кДНК штамма, которая была матрицей выравнивания. К упомянутому секувару был отнесен изолят Muskovy duck/Ukraine/2005.

Остальные анализируемые изоляты вируса относились к одной большой группе, которая содержала в своих последовательностях анализируемой области гена F 54 нуклеотидных замены, в т.ч. 4 тандемных (2-4 п.н.) по отношению к матрице выравнивания. В рамках этой выборки нами идентифицировано еще два секувара. К первому из них, базовому, относились вирусы, выделенные от дикой птицы (NDV/WB/2006), а ко второму – изоляты NDV/Dnipro/2007 и NDV/Taranivka/93.

Топографически на сконструированном с помощью метода Minimum Evolution филогенетическом дереве (рис.) упомянутые четыре изолята размещались отдельно от изолята Muskovy duck/Ukraine/2005. Кладистически они оказались в одной группе с изолятом Хабаровск, который в свою очередь, несет типичные нуклеотидные замены для российской группы штаммов. Дивергенция внутри этой группы по нуклеотидным различиям анализируемой последовательности составила до 0,5 %.

Изолят Muskovy duck/Ukraine/2005 показал 0,7 % отличий по анализируемой области в сравнении с другими украинскими изолятами и оказался наиболее близким к Бельгийскому изоляту. Числовые индексы Boot-Strap для ветвления украинских изолятов колебались от 99 (Muskovy duck/Ukraine/2005) до 78 (другие изоляты украинской группы). Проведенный анализ дает возможность предположить вероятное западноевропейское происхождение изолята Muskovy duck/Ukraine/2005 и предполагаемое российское происхождение изолятов от дикой птицы, а также изолятов NDV/Dnipro/2007 и NDV/Taranivka/93.

ВЫВОД
На основании анализа нуклеотидных последовательностей участка гена F вируса ньюкаслской болезни длиной 512 п.н. изолятов вируса НБ установлено западноевропейское происхождение изолята NDV/Muscovy duck/2005 и российское – изолятов NDV/Dnipro/2007, NDV/WB/19/2006, NDV/WB/22/2007 и NDV/Taranivka/93.

Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Aldous E.W., Mynn J.K., Banks J., Alexander D.J.: A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene. Avian Pathol 2003 32(3), 239-256.
2. Lamb R.A., Collins P.L., Kolakofsky D., Melero Y., Nagai Y., Oldstore M.B.A., Pringle C.R., Rima B.K.: Family Paramyxoviridae. In: Virus Taxonomy 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, edited by van Regenmortel M.V.H., New York: Academic Press 2000, pp. 549-561.
3. Collins M.S., Bashiruddin J.B., Alexander D.J. Deduced amino acid sequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease viruses showing variation in antigenicity and pathogenicity: Arch of Virol. 1993 128, 363-370.
4. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals O.I.E. 6th Edition, Paris 2008 1 and 2, 1343 p.
5. Cattoli G., Manvell R.J., Tisato E., Banks J., Capua I.: Characterization of Newcastle disease viruses isolated in Italy in 2000. Avian Pathology 2001 30, 465-469.

Подготовлено по материалам «Vого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com