Молекулярные методы контроля болезни Гамборо (IBD)

Доктор Marcos Bentué «Laboratorios Hipra» Испания

Европейская птицеводческая индустрия уже в течение долгого времени сталкивается лицом к лицу с вирусом IBD, который распространился по всему миру, включая большинство африканских стран. Начиная с конца 80-х острые и тяжелые вспышки IBD, с 30%-ой смертностью в бройлерных хозяйствах, были зарегистрированы в нескольких европейских странах. Высокая смертность указывала на увеличение патогенности штаммов IBD, которые были классифицированы как высоковирулентные IBDV (vvIBDv). Болезнь легко диагностируется, если во время полевой вспышки присутствуют смертность и клинические признаки. Однако существует много случаев, когда постановка диагноза является гораздо более трудной задачей: субклиническое течение IBD, позднее проявление IBD, взаимодействие нескольких иммунодепрессивных факторов.

Доступные диагностические методы IBD

Традиционно диагноз болезни Гамборо устанавливали, используя несколько методов, разработанных для обнаружения вируса или антител, выявляемых непосредственно вирусом. Когда идет речь об обнаружении антител, выявляемых вирусом, используются три основных диагностических метода: Elisa, тест диффузионной преципитации в агаровом геле и вирусная нейтрализация. В настоящее время Elisa широко используется и обычно применяется, для оценки иммунного ответа на вакцины, и с целью обнаружения возможного контакта с полевыми вирусами IBD. Два других метода (РДП и РН) обычно не используются, так как они являются недостаточно чувствительными или достаточно трудоемкими. Обнаружение вируса выполняется методом изоляции вируса, окраски и молекулярной диагностики. Изоляция вируса проводится на СПФ эмбрионах. Данный метод является очень чувствительным, но дорогостоящим и трудоемким. Методика окрашивания (иммунопероксидаза и иммунофлюоресценция) обладает низкой чувствительностью, так как для ее применения требуется высокая концентрация вируса, и она должна быть использована в острой фазе инфекции. И, наконец, последние методы – методы молекулярной диагностики, которые позволяют обнаружить генетический материал вируса.

Молекулярные методы обладают целым рядом преимуществ

В настоящее время, мы обладаем различными молекулярными диагностическими инструментами, для определения присутствие вируса IBD и впоследствии идентификации определенных видов штаммов (типирование). Данные молекулярные методы очень чувствительны и обеспечивают получение достоверной информации, и в последнее время, становятся все более и более популярными. Большинство молекулярных методик направлено на определение порядка вариабельной области гена VP2, который состоит из 345 нуклеотидов. Данный участок, как известно, кодирует антигенные детерминанты вируса, индуцирующие выработку нейтрализующих антител, которые обеспечивают иммунитет против болезни Гамборо. Кроме того, мутации нуклеотидов и аминокислот могут происходить в переменной области VP2. Это важно для изучения вариабельной области VP2 с целью дифференциации антигенных свойств у разных штаммов вируса IBD. Также возможно определение патотипов, поскольку известно, что некоторые аминокислоты, находящиеся в разных положениях в вариабельной области, являются индикаторами патогенности вирусов болезни Гамборо ( Аланин 222, Изолейцин 256, Изолейцин 294). Они являются маркерами патогенности вируса.

RT/PCR-REA обнаруживает и идентифицирует вирусы IBD

Обнаружение вируса Гамборо выполняется при помощи метода RT/PCR (метод ПЦР – рестрикции с применением обратной транскрипции и определением длинны полиморфного фрагмента цепочки). Используя данную методику, можно обнаружить все штаммы IBD, независимо от их уровня патогенности и антигенной структуры. Методом фенотипирования является – REA (Рестрикционнный Энзимный Анализ). Продукты PCR обрабатывают различными рестриктазами (нуклеазами – ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты), которые позволяют дифференцировать vvIBD (высоковирулентные штаммы IBD) от классических патогенных вирусов IBD. Рестриктазы могут рассматриваться в качестве ножниц для генетического материала, которые разрезают ДНК в определенном порядке.

Рис. 1. Молекулярные методы, такие как RT/PCR в реальном времени с последующей рестрикцией, являются очень эффективными для обнаружения и дифференциации вирусов IBD:

Дифференциация vvIBDV (высоковирулентного вируса IBD) от cvIBDV (классический патогенный вирус IBD). BspMI рестриктаза «разрезает» высоковирулентный штамм IBD (полоска 3) и не оказывает действия на классический патогенный штамм IBD (полоска 7). SacI рестриктаза не «разрезает» vvIBD (полоска 2), но делает это в полоске 6 (cvIBD). Таким образом, можно идентифицировать оба вируса IBD.

Сиквенс дает наиболее исчерпывающую информацию

Сиквенс определяет последовательность всех нуклеотидов в гипервариабельной области. После сиквенирования, можно получить подробную информацию о мутации и ее последствиях для аминокислот. Кроме того можно определить участки расщепления любой рестриктазы. Оценка влияния мутаций на биологическую функцию или антигенные свойства вируса IBD до сих пор являются предметами для дискуссий. После выполнения сиквенирования также можно провести филогенетические исследования, чтобы определить уровень родства среди различных вирусов IBD. И, кроме того, установить гомологию VP2 между различными вирусами IBD.

График 1
Гомология Hipragumboro-GM97 со штаммами vvIBDV, полученными из разных европейских стран

Практическое применение молекулярных методов

Рекомендуется регулярно проводить мониторинг вируса IBD в птицеводческих хозяйствах для оценки штаммов, циркулирующих на бройлерных птицефабриках для того, чтобы иметь возможность правильно составить схему вакцинации.

Рис. 3. Техника отпечатка на карте FTA®

Рис.4 Карта FTA® после взятия образцов

В настоящее время карты FTA® дают прекрасную возможность для отправки образцов патологического материала в лаборатории, так как они сохраняют генетический материал вируса. У карт FTA® есть 4 зоны, для фиксации отпечатков образцов (круглые области на внешнем крае каждой карты). Рекомендуется использовать одну или две карты (по четыре области накарте) для одного птичника. В центре круга делают отпечаток образца бурсы. После чего дают отпечаткам высохнуть на воздухе в течение от 40 минут – 1 часа. Как только карта полностью высохнет, она упаковывается в индивидуальный полиэтиленовый пакет и отправляется в лабораторию.

В лаборатории образцы с карт FTA® исследуют следующими методами:
– RT-PCR (ПЦР с применением обратной транскрипции). Этот метод позволяет обнаружить вирус и дает возможность определить время инфицирования, или качество проведенной вакцинации.
– REA (Рестрикционный анализ): идентификация вируса. Этот метод помогает отличить полевой вирус от вируса вакцины.
– Сиквенирование: позволяет изучить особенности циркулирующего вируса и сравнить его с различными IBD вирусами.

Програмы технической подержки: Lymfos VAC и Lymfos BROILERS

Технические программы дают основные рекомендации по стратегии борьбы с болезнью Гамборо. Эти программы направлены на изучение и контроль болезни Гамборо. В настоящее время компания Hipra предлагает две разные программы, Lymfos VAC и Lymfos BROILERS, которые уже успешно применяются целым рядом компаний во всем мире. Эти программы предусматривают серию последовательных исследований, основанных на еженедельном отборе образцов Фабрициевых сумок.

Образцы исследуют молекулярными методами диагностики, такими как RT-PCR (Обратно транскриптазная-полимеразная цепная реакция) в сочетании с рестрикционным энзимным анализом (РЭА). Проводится секвенирование VP2 и филогенетические исследования с целью определения гомологии IBD вирусов, циркулирующих в хозяйстве с другими референтными вирусами.

Lymfos VAC

Конечной целью вакцинации является обеспечение рентабельного производства птицы. К сожалению, эффективность вакцин зависит от ряда других факторов, которые не связаны непосредственно с вакцинами. Чтобы убедиться в успешности вакцинации, необходимо получить подтверждение факта проникновения вируса вакцины в бурсу и его дальнейшей репликации в ней при помощи молекулярных методов.

Программа Lymfos VAC начинается в момент вакцинации, который является первой отправной точкой для взятия проб патологического материала. Как только подтверждено, что цыплята не инфицированы vvIBDv или другим циркулирующим в хозяйстве вирусом IBD, необходимо убедиться, что бурсы не инфицированы и готовы к заселению вирусом вакцины. С другой стороны, если бурсы уже инфицированы, можно сделать вывод о том, что возможности вакцины по защите против болезни Гамборо будут значительно ограничены. Следующее еженедельное взятие проб будет через 7 дней после прививки, и это исследование позволит сделать вывод о том, был ли вирус вакцины способен колонизировать бурсу в достаточной степени. Если результат будет неудовлетворительным, и вакцина не колонизировала бурсу, в хозяйстве все еще будет достаточно времени для повторной вакцинации птицы и для создания удовлетворительного уровня защиты.

Lymfos BROILERS

С программой Lymfos BROILERS, еженедельное осуществление отбора проб начинается во время прививки и может продолжаться до конца периода откорма. Для того чтобы определить динамику развития инфекции и определить точное время, когда бройлеры становятся инфицированными. Эта информация будет основой для применения правильной стратегии защиты следующих туров бройлеров. Кроме того, проводят исследование степени специфического поражения бурсы и определение патогенности полевого вируса. Опыт работы доказывает важность определения специфичности вирусов болезни Гамборо, циркулирующих на бройлерной ферме период откорма. Кроме того, крайне важно определить момент, когда птица может быть инфицирована, а также определить источники или резервуары полевого вируса. Таким образом, технические программы Lymfos VAC и Lymfos BROILERS позволят обнаружить «скрытые угрозы», и, тем самым, обеспечить успех в борьбе с болезнью Гамборо.

Подготовлено по материалам «Vого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com