Научное сопровождение проблемы высокопатогенного гриппа птицы в Украине

Б.Т.Стегний, Д.В.Музыка, А.Н.Головко, А.П.Герилович, А.Б.Стегний, В.А.Головко,1 А.Н.Рула, М.Ю.Стегний, Дрыгин В.В.2, Мудрак Н.С.2

Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», г. Харьков, Украина
* Харьковская государственная зооветеринарная академия, г. Харьков, Украина
** ФГУ «Федеральный центр охраны животных», г. Владимир, Россия

Грипп А – опасное вирусное заболевание животных, птиц и человека. Особую актуальность в последние годы приобрел высокопатогенный грипп птиц, который вызывается подтипом H5N1. Вирусы гриппа с такой антигенной формулой вызывают массовую гибель сельскохозяйственных и диких птиц различных видов, тем самым причиняя огромные экономические убытки. Так, по предварительным подсчетам, во время эпизоотии высокопатогенного гриппа в 2005-2006 годах, которая охватила практически весь Евроазиатский континент и часть Африканского, было уничтожено около 200 млн. голов домашней птицы, экономический ущерб составил приблизительно 1 млрд. долларов США [4, 5].

Согласно данным Международного эпизоотического бюро высокопатогенный грипп птицы в 2007 году был зарегистрирован в 42 странах Европы, Азии, Африки. С начала 2008 года это заболевание уже выявлено в 13 странах, в том числе и в Украине. Впервые в Украине высокопатогенный грипп птиц был зарегистрирован в 2005 году. По данным Государственного комитета ветеринарной медицины Украины начиная с 2005 года на Украине высокопатогенный грипп птиц был зарегистрирован в 4 регионах страны (АР Крым, г. Одесса, Херсонская и Сумская области). В 2008 году вспышка высокопатогенного гриппа птиц была зарегистрирована на частной птицефабрике в с. Ровное Красногвардейского района АР Крым [1].

Особую обеспокоенность Всемирной организации охраны здоровья представляет способность вирусов гриппа H5N1 вызывать заболевание и гибель людей. Так, по данным ВООЗ в мире, начиная с 2003 года, гриппом, который вызывается подтипом H5N1, заболел 361 человек, из которых 227 умерли. По мнению специалистов ВООЗ вирусы гриппа H5N1 являются одним из кандидатов в пандемические вирусы [2].

Таким образом высокопатогенный грипп птиц это не только сугубо ветеринарная проблема, но и общегосударственная, и даже общемировая экономическая и социальная проблема.

Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» является ведущим научным учреждением, которое осуществляет научное сопровождение всех ветеринарных проблем, связанных с обеспечением эпизоотического благополучия страны и контроля качества пищевых продуктов животного происхождения. В 2005 году для научного сопровождения проблемы гриппа в ННЦ «ИЭКВМ» была создана Референс-лаборатория по гриппу птиц. Основными направлениями её деятельности является постоянный эпизоотический мониторинг гриппа птицы среди домашних и диких птиц, изоляция, идентификация возбудителя гриппа, изучение его биологических и молекулярно-генетических свойств, разработка и испытание отечественных средств специфической диагностики и профилактики.

Эпизоотологический мониторинг гриппа в популяциях диких и сельскохозяйственных птиц. Исследования диких птиц проводятся сотрудниками института уже более 7 лет в местах массовых скоплений диких птиц во время миграции и гнездования на озере Сиваш, заповеднике «Аскания-Нова», Черноморском заповеднике, а также в других регионах Украины. За последнее время былипроведены исследования около 5 тыс. диких птиц 70 видов. Большинство из них относится к водоплавающим и околоводным птицам – основному резервуару вирусов гриппа в природе. Результаты исследований свидетельствуют о широкой циркуляции вирусов гриппа в популяциях диких птиц, в том числе и подтипа H5N1. Так в 2006 году у диких птиц были выявлены антитела к вирусу гриппа А подтипов: Н1, Н2, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, а в 2007 – Н3, Н5, Н6, Н8, Н9, Н13, Н14. Большое внимание уделяется изучению эпизоотической ситуации среди домашних птиц в приусадебных хозяйствах.Особенность этих хозяйств в том, что птица не всегда содержится в соответствии с ветеринарно-санитарными требованиями (совместное содержание птиц разных видов и возраста, совместное содержание с сельскохозяйственными животными, нарушение «закрытого» режима содержания птицы). Это в свою очередь создает предпосылки для проникновения и распространения среди птиц ряда инфекционных болезней, в том числе и высокопатогенного гриппа. Особенно это касается «зон риска» – территорий где высокая вероятность контактов домашних птиц приусадебных хозяйств с дикими.

Участие в противоэпизоотических мероприятиях при ликвидации очагов высокопатогенного гриппа птиц.Важным направлением работы ННЦ «ИЭКВМ» является участие в противоэпизоотических мероприятиях при вспышках гриппа на территории Украины. Сотрудники института, начиная с первых дней возникновения очагов высокопатогенного гриппа птиц на территории Украины в 2005–2006 годах в АР Крым, принимали активное участие в постановке диагноза, изоляции возбудителя, его идентификации, изучении биологических и молекулярно-генетических особенностей.

Начиная с 2005 года изолированно несколько штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц H5N1 от сельскохозяйственных и диких птиц. Наиболее изученными являются штаммы вируса гриппа А/курица/Сиваш/02/05 А/курица/Приморский/02/06. Тщательно были изучены их биологические и молекулярно-генетические свойства, проведено секвенирование генома, определена патогенность вируса для цыплят по внутривенному индексу патогенности, проведены электронно-микроскопические исследования, изучены культуральные и антигенные свойства вируса, их способность сохраняться при низких и сверхнизких температурах. Во время ликвидации очага высокопатогенного гриппа птиц на одной из птицефабрик были разработан ряд мероприятий по обеззараживанию птицы и навоза, которые дали возможность предотвратить дальнейшее распространение заболевания.

Во время последней вспышки высокопатогенного гриппа птицы на птицефабрике в с. Ровное Красногвардейского р-на. в АР Крым специалисты принимали активное участие в постановке диагноза. Было изолированно несколько штаммом вируса высокопатогенного гриппа птиц от сельскохозяйственных птиц. Сейчас продолжается изучение биологических и молекулярно-генетических свойств этих вирусов. Также было проведено эпизоотологическое обследование домашних птиц (кур, гусей, уток) и свиней приусадебных хозяйств в селе, расположенном недалеко от птицефабрики, а также диких птиц на прилегающей территории. По результатам этих исследований были предоставлены рекомендации Государственному комитету ветеринарной медицины Украины.

Разработка средств специфической профилактики и диагностики высокопатогенного гриппа птиц. Причиной возникновения гриппа в большинстве случаев является нарушение элементарных ветеринарно-санитарных требований при содержании птицы. Основным природным резервуаром и источником инфекции для сельскохозяйственной птицы являются дикие птицы. Это представляет большую опасность для домашних птиц, которые свободно содержатся в приусадебных хозяйствах, имеют свободный доступ к открытым выгулам и открытым водоемам, могут свободно контактировать с дикими птицами. Особенно это касается водоплавающих птиц (уток, гусей). Поэтому в качестве одного из мероприятий по контролю и недопущению возникновения заболевания может применяться специфическая профилактика высокопатогенного гриппа с использованием инактивированных вакцин. Это особенно касается так называемых «зон риска» – населенных пунктов, расположенных на путях миграции, в местах массового гнездования и скопления диких птиц.

На сегодняшний день сотрудники ННЦ «ИЭКВМ» работают над созданием целого ряда отечественных инактивированных вакцин против высокопатогенного гриппа птиц. Уже разработана технология изготовления инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц «АвиФлуВак-ИЭКВМ» из гомологичного штамма. На завершающей стадии находится разработка технологии изготовления вакцины из гетерологичного штамма H5N3 и ассоциированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц и болезни Ньюкасла.

Для создания отечественной инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц «АвиФлуВак-ИЭКВМ» был выбран эпизоотический гомологичный штамм А/курица/Сиваш/02/05, который был изолирован сотрудниками нашего института от больных кур во время вспышки высокопатогенного гриппа птиц в АР Крым в 2005 году. Путем селективного клонирования на СПФ куриных эмбрионах, культурах клеток, а также путем подбора условий культивирования был получен производственный штамм вируса гриппа А/курица/Сиваш/02/05 H5N1, который обеспечивал высокое качество вирусного сырья с высоким титром гемагглютининов 10–12 log2. Производственный штамм депонирован в Государственном научно-контрольном институте биотехнологии и штаммов микроорганизмов (№ 383). На этот производственный штамм получен декларационный патент Украины № 20245.

Следующим этапом разработки технологии был подбор инактиванта и регламент инактивации, которые обеспечивали полную инактивацию инфекционной активности вируса и не оказывал влияния на антигенные и иммуногенные характеристики вируса. Было установлено, что оптимальным инактивантом для вируса является формальдегид. Его использование позволяло полностью нейтрализовать инфекционность вируса при полной сохранности протективных антигенов. Препараты вируса инактивированные при помощи формальдегида не вызвали гибели куриных эмбрионов и цыплят, а также индуцировали у птицы выработку специфических антител.

Одним из основных компонентов инактивированных вакцин есть адъюванты, которые обеспечивают формирование стойкого длительного иммунитета у вакцинированной птицы. Поэтому этому этапу исследований мы также уделили большое внимание. Нами были испытаны различные адъюванты и различные технологии эмульгирования. По результатам проведенных исследований оптимальным оказался адъювант Montanid ISA 70 фирмы SEPPIC (Франция).

По разработанной технологии было изготовлено несколько серий вакцины для проведения лабораторных испытаний, а также для подбора оптимальной дозы вакцины для различных видов сельскохозяйственной птицы. По результатам этих исследований установлено, что доза для кур составляет 0,5 см3, для уток – 1,0 см3, гусей – 2,0 см3, индеек – 1,0 см3. Также было установлено, что срок хранения вакцины при температуре плюс 2 – 80С составляет 12 месяцев с момента изготовления.

Вакцина «АвиФлуВак-ИЭКВМ» прошла государственные комиссионные испытания на Херсонской государственной биофабрике и производственные испытания в одном из сел Херсонской области. Контроль качества вакцины проводился согласно требованиям МЭБ и Государтвенного научно-контрольного института биотехнологии и штаммов микроорганизмов [3]. По всем показателям качества: внешний вид, цвет, вязкость, отсутствие посторонних примесей, стабильность эмульсии, остаточное количество инактиванта вакцина соответствовала международным стандартам. Особое внимание было уделено таким показателям как полнота инактивации вируса, безвредность вакцины, антигенные и иммуногенные свойства. Испытания вакцины показали, что вирус, использованный при изготовлении вакцины, полностью инактивирован и не вызывает гибели куриных эмбрионов при проведении трех «слепых» пассажей. Введение подопытной птице двукратной дозы вакцины не влияло на клиническое состояние птицы, на ее продуктивность, в месте введения биопрепарата не было отмечено местной реакции. При оценке антигенных свойств вакцины установлено, что введение ее птице в рекомендованных дозах вызывало образование специфических антител. Так через 21 день после однократного введения вакцины титр антител в сыворотке крови кур составил 6,30 ± 0,42 – 6,80 ± 1,88 log2, а через 21 день после повторного введения препарата – 9,25 – 11,40 log2. Уровень антител у уток, гусей и индеек составил соответственно 6,6 ± 2,06; 6,4 ± 0,89 та 7,5 ± 0,57 log2. Иммуногенная активность была проверена путем прямого контрольного заражения эпизоотическим штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц. Эти исследования проводились в специальных условиях с использованием боксов биозащиты 3 класса. Для опыта было сформировано две группы цыплят: опытная (вакцинированная против высокопатогенного гриппа птиц) и контрольная (не вакцинированная). Птица обеих групп была инфицирована эпизоотическим контрольным вирусом. За птицей было установлено наблюдение. На протяжении 7 дней ежедневно от птицы двух групп отбирались клоакальные смывы для оценки степени вирусовыделения у вакцинированной птицы после заражения. Результаты испытаний показали, что цыплята контрольной группы (не вакцинированные) погибли с типичными клиническими признаками высокопатогенного гриппа птиц через 36– 40 часов. С клоакальных смывов этой птицы был реизолирован возбудитель. В тоже время все цыплята опытной группы (вакцинированные) на протяжении 14 дней наблюдения оставались клинически здоровыми и на протяжении 7 дней не выделяли возбудителя в окружающую среду.

По результатам испытаний вакцина была признана безопасной, безвредной для птицы и была рекомендована для практики ветеринарной медицины. На вакцину «АвиФлуВак-ИЭКВМ» разработана научно-техническая документация (ТУ У 24.4-00497087-041:2006, инструкция по изготовлению). Вакцина зарегистрирована в Украине (регистрационное свидетельство № 2297-04-0267-06 от 26.12.2006).

Продолжаются исследования по разработке технологии изготовления бивалентной ассоциированной инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Для этих исследований были использованы производственный штамм вируса высокопатогенного гриппа птиц А/курица/Сиваш/02/05 и эпизоотический штамм вируса болезни Ньюкасла «ЛГ-85». Проведены первые опыты по определению антигенной активности биопрепарата. Установлено, что через 60 дней после вакцинации уровень антител к вирусу гриппа птиц Н5 в сыворотке крови индеек составил 6,0 – 7,5 log2, а к вирусу болезни Ньюкасла – 5,0 – 7,0 log2. При вакцинации кур уровень антител к вирусу гриппа Н5 составил через 21 день – 11 log2, через 42 дня – 7,5 log2, к вирусу болезни Ньюкасла через 21 день – 9,8 log2, через 42 дня – 10 log2. На данный момент завершается утверждение научно-технической документации на эту вакцину. На инактивированную вакцину против высокопатогенного гриппа птиц и болезни Ньюкасла получен декларационный патент Украины № 25751.

Важным аспектом контроля высокопатогенного гриппа птиц является своевременная и быстрая диагностика заболевания. В основе правильной диагностики лежит использование высокоспецифичных и высокочувствительных тест-систем. Поэтому нами были разработаны различные тест-системы как на основе классических (реакции задержки гемагглютинации, диффузной преципитации), так и новейших методов (полимеразной цепной реакции).

Как для разработки вакцин, так и для разработки диагностических препаратов важным является использование эпизоотически актуальных штаммов вируса. Поэтому и для разработки тест-систем мы использовали вирус высокопатогенного гриппа А/курица/Сиваш/02/05 H5N1. Нами отработана технология накопления вирусной биомассы с высоким титром гемагглютининов, подобран инактивант, регламент инактивации, специальная защитная среда, которая обеспечивает стабильность инактивированного антигена при хранении. Путем иммунизации кур получена положительная сыворотка с титром антигемаглютининов к вирусу высокопатогенного гриппа 7–9 log2.

Тест-система прошла апробацию на большом количестве полевых сывороток и желтков яиц сельскохозяйственных и диких птиц различных видов. Она была испытана с использованием референтных наборов сывороток и антигенов Великобритании, Италии и России, сейчас активно используется в лабораторной диагностике и при проведении мониторинговых исследований.

На стадии лабораторных испытаний и апробации находится еще три тест-системы: для выявления антител к вирусу гриппа птиц 14 подтипов в сыворотке крови и желтках диких и сельскохозяйственных птиц, а также для индикации антител в реакции диффузной преципитации и в ИФА.

Что касается разработки молекулярно-генетических средств диагностики согласно результатам исследований генов вируса А подтипа Н5N1 разработаны праймерные системы и методики их применения для индикации вируса высокопатогенного гриппа птиц. На основании этих прамеров предложена «Тест-система для выявления РНК высокопатогенного гриппа птиц» (ТУ У 24.4-00497087-060:2007), которая нашла широкое применение при проведении мониторинговых исследований.

Выводы
1. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» – ведущее научное учреждение ветеринарной медицины Украины, которое проводит научное сопровождение проблемы высокопатогенного гриппа птиц в Украине. Основными направлениями работы являются проведение эпизоотического мониторинга в отношении гриппа среди сельскохозяйственных и диких птиц, участие в изоляции возбудителя, его идетификации, определения патогенности, выяснения источников и путей распространения инфекции при возникновении очагов высокопатогенного гриппа птиц на территории Украины, а также разработка средств специфической профилактики и диагностики

2. Результаты эпизоотологического мониторинга свидетельствуют о широкой циркуляции возбудителя гриппа в популяциях диких мигрирующих птиц, что подтверждает необходимость его постоянного проведения в зонах риска. Это даст возможность своевременно прогнозировать развитие эпизоотической ситуации.

3. В Национальном научном центре «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» разработана технология изготовления инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц «АвиФлуВак-ИЭКВМ», которая отвечает всем международным стандартам качества и обеспечивает формирование стойкого иммунитета против высокопатогенного гриппа птиц. Титр антител в сыворотке крови сельскохозяйственной птицы составляет 9,25 – 11,40 log2. Вакцинированная птица устойчива к контрольному заражению эпизоотическим штаммом и не выделяет его в окружающую среду. На завершающем этапе находятся исследования по разработке бивалентной инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа птиц и болезни Ньюкасла, а также инактивированной вакцины против высокопатогенного гриппа из гетерологичного штамма.

4. Для диагностики гриппа птиц разработаны чувствительные и специфические тест-системы для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипов Н1 – Н14, в том числе и к вирусу H5N1 в реакции задержки гемагглютинации, а также ПЦР тест-системы для молекулярной диагностики. Разработанные тест-системы активно используются в Украине для диагностики гриппа у сельскохозяйственных и диких птиц.

Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Державний комітет ветеринарної медицини [Електор. ресурс] / Спосіб доступу: http://www.vet.org.ua – Заголовок з екрану
2. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO [Електр. ресурс] / Спосіб доступу: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2008_02_15/en/index.html – Заголовок з екрану
3. OIE Manual for Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Електр. ресурс] / Спосіб доступу: http://www.oie.int.– Заголовок з екрану
4. Lee C.W., Suarez D.L. Avian influenza virus: prospects for prevention and control by vaccination// Anim. Health Res. Rev. – 2005. – Vol. 6. – P.: 1–15.
5. WHO 2005. The Writing Committee of the World Health Organization. Avian influenza A (H5N1) infection in humans// N. Engl. J. Med. – 2005. – Vol. 353. – P.: 1374–1385.

Подготовлено по материалам «Vого Международного Ветеринарного Конгресса по Птицеводству» для webmvc.com