Ромашова Н Б.1, Пустовит Н.С.2, Штанников А.В.3, Транквилевский Д.В.4, Ромашов Б.В.1

1.Воронежский биосферный заповедник,
2.Ветеринарная клиника «Центр», г. Москва,
3.Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск,
4.Центр гигиены и эпидемиологии по Воронежской области, г. Воронеж

Источник: материалы XVII Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных

Болезнь Лайма, или иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) относится к группе природно-очаговых зоонозов с трансмиссивным механизмом передачи возбудителей. Территория России является наиболее протяженным (от побережья Балтийского моря до Тихого океана) регионом ИКБ в мире. Преимущественно случаи заболевания отмечены в лесной и лесостепной зонах России (Коренберг и др., 1986; 1996; 2002; Наумов, Васильева, 2005). В природных очагах возбудители ИКБ циркулируют в составе системы «иксодовые клещи↔дикие животные». Установлена трансфазовая передача боррелий у большинства иксодовых клещей, трансовариально возбудители, как правило, не передаются (Алексеев, Дубинина 1994). Основное эпидемическое значение на территории России имеют клещи рода Ixodes (I. persulcatus и I. ricinus), характеризующиеся чрезвычайно широким кругом прокормителей и наибольшей агрессивностью по отношению к человеку. Ареал возбудителей ИКБ в России совпадает с ареалами иксодовых клещей (Коренберг и др., 1987). В центральных и восточных районах и на отдельных территориях лесной зоны европейской части России наиболее распространенным является I. persulcatus, а в более южных и западных районах – I. ricinus. Природные очаги заболевания циркулируют в рамках популяционных группировок всех компонентов паразитарной системы – боррелий, иксодовых клещей (все фазы развития) и диких млекопитающих. Возможно, в циркуляции участвуют и другие группы позвоночных в качестве резервуарных хозяев.

Риск заражения и частота заболеваний человека и домашних животных определяются количественными и качественными параметрами всех компонентов паразитарной системы в природных очагах ИКБ. Главными экологическими факторами риска заражения являются число инфицированных клещей и интенсивность контакта с ними животных (и человека). В свою очередь на уровни обсемененности иксодовых клещей возбудителями трансмиссивных заболеваний влияет, во-первых, их численность (чем выше численность клещей, тем выше вероятность встречи с зараженными хозяевами), во-вторых, видовое разнообразие и численность животных-прокормителей и степень их зараженности боррелиями. Следовательно, для оценки эпидемического и эпизоотического рисков в отношении ИКБ в условиях конкретных территорий необходимы сведения об эколого-биологических особенностях циркуляции боррелий. В данном контексте предполагается изучение взаимоотношений между основными компонентами паразитарной системы очага – иксодовыми клещами, патогенными боррелиями, животными-прокормителями, включая резервуарных хозяев.

Воронежская область является неблагополучной по целому ряду природно-очаговых заболеваний человека и животных (Ромашов и др., 2005; 2006), в том числе передаваемых через иксодовых клещей. В последнее время на территории области постоянно регистрируются случаи заболевания людей «местным» (эндемическим) боррелиозом, что указывает на существование здесь устойчивых природных очагов инфекции. На данной территории каких-либо исследований посвященных ИКБ не проводилось. Имеются лишь немногочисленные и фрагментарные данные по фауне и видовому разнообразию иксодовых клещей. В этой связи изучение экологических, эпизоотологических и эпидемиологических проблем ИКБ на данной территории является актуальным.

Территория Воронежской области расположена преимущественно в лесостепной зоне. Наиболее характерными экологическими чертами этой территории является сочетание открытых пространств с островными лесами. Последние представляют собой «острова» наиболее высокого видового разнообразия и численности фаунистических и флористических комплексов. В этих условиях, как правило, сосредоточен и основной потенциал возбудителей природно-очаговых инфекций и инвазий. Крупнейшим островным лесом Воронежской области является Усманский бор, на территории которого расположен Воронежский заповедник. Территория заповедника выбрана нами в качестве полигона для проведения исследований, посвященных изучению эколого-биологических и эпизоотологических аспектов ИКБ, а также репрезентативных оценок инфекционного потенциала и лоймологического риска в отношении этой инфекции в условиях лесостепной зоны центра европейской России.

В основе этого сообщения лежат результаты оригинальных исследований по различным аспектам ИКБ. Сбор материалов производили на территории Воронежского заповедника с апреля по октябрь 2008 года. Материалами для настоящих исследований послужили, во-первых, иксодовые клещи родов Ixodes и Dermacentor, во-вторых, домашние собаки (из заповедника и сопредельных территорий), у которых была взята кровь для диагностики ИКБ. Сбор клещей производили в соответствии с принятыми методиками – на флаго/км. На выделенных маршрутах учитывали видовое разнообразие, относительную численность и половозрастной состав иксодовых клещей. В период исследований регистрировали метеорологические параметры – колебания суточной температуры и влажность.

На выделенных 7 маршрутах за полевой сезон отработано 220,5 флаго/км и собрано 759 экз. иксодовых клещей. Зараженных боррелиями иксодовых клещей выявляли при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее разновидности, полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Исследовано свыше 300 экз. I. ricinus. Для обнаружения в содержимом кишечника клеща ДНК патогенных боррелий из группы Borrelia burgdorferi s.l. в качестве матрицы для амплификации использовали часть OspA-гена, кодирующего главный поверхностный липопротеин. Для идентификации и генотипирования боррелий использовали модификацию метода ПЦР, основанную на амплификации области разделяющей тандем 5S и 23S рибосомальных генов. Эти гены у представителей B. burgdorferi s.l. дуплицированы. По-видимому, такая комбинация не встречается ни у энтеробактерий, ни у других групп боррелий, что делает этот спайсер уникальной и удобной матрицей для генотипирования. Его нуклеотидная последовательность отличается у различных геновидов B. burgdorferi s.l., что выявляется при рестрикции получаемых в ПЦР амплификатов. Продукты рестрикции анализировали по картине их распределения при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПДРФ-ПЦР). Метод удобен тем, что не требует специальной обработки исследуемого образца, большого количества ДНК, позволяет дифференцировать нескольких видов боррелий в одной пробе. Для повышения чувствительности все исследуемые образцы были тестированы в режиме «гнездовой» ПЦР (nest-PCR). Собаки являются наиболее вероятными прокормителями клещей и подвержены риску инфицирования боррелиями. Для оценки уровня инфицированности собак, постоянно обитающих в эндемичном ареале (Воронежском заповеднике и сопредельных территориях) и имеющих контакт с клещами (собаки жителей поселка Центральная усадьба заповедника, кордонов заповедника, некоторых близлежащих населенных пунктов) были проведены серологические обследования. Всего на этой территории в 2008 году исследовано 82 собаки. Для каждого животного была составлена анкетная карточка, включающая характеристику животного и данные о нападениях клещей. Серодиагностику боррелиоза у собак для выявления зараженных и иммунных животных проводили иммунохимическими методами, используя разработанные собственные тест-системы для ELISA и WB на основе суммарного клеточного антигена боррелий. При необходимости, для улучшения чувствительности и специфичности иммунохимической тест-системы в нее дополнительно вводили рекомбинантные и синтетические антигены BBK 32, DbpA, Vls E, клонированные из региональных изолятов. В качестве контроля использовали сыворотки животных с достоверным диагнозом болезни Лайма и моноклональные антитела из референс-панели, предоставленные CDC (USA). Кроме разработанных тест-систем тестирование сывороток проводили коммерческими наборами, разработанными на основе VslE домена.

В течение полевого сезона 2008 года на территории Воронежского заповедника отмечено два вида иксодовых клещей сем. Ixodidae – Ixodes ricinus и Dermacentor reticulatus. По нашим наблюдениям первые случаи появления активных клещей были зафиксированы во второй половине марта, с момента начала таянья снега и перехода среднесуточных температур через +1°С. На каждом из маршрутов нами произведена оценка относительной численности клещей. Совокупно величина относительной численности составила в среднем 3,4 экз. на флаго/км, соответственно, I. ricinus – 2,2 экз., D. reticulatus – 1,2 экз. В период сезона активности прослежена динамика численности (активности) иксодовых клещей по месяцам (рис.).

Динамика относительной численности I. ricinus и D. reticulatus (на флаго/км) на территории Воронежского заповедника

Рис. Динамика относительной численности I. ricinus и D. reticulatus (на флаго/км) на территории Воронежского заповедника (полевой сезон 2008 г.).

Для D. reticulatus характерен апрельский пик численности, для I. ricinus отмечен ярко выраженный пик численности в мае, с последующим некоторым снижением активности вплоть до середины лета. Минимальные показатели численности у обоих видов отмечены в июле. В последующие три месяца наблюдали постепенное нарастание численности, но величины, в сравнении с весенними, были существенно ниже (рис.). Отмечены и другие особенности в экологии иксодовых клещей. В частности, на маршрутах, где зарегистрирована наиболее высокая численность D. reticulatus, для I. ricinus выявлены минимальные показатели численности. Эти особенности можно объяснить влиянием нескольких экологических факторов. Во-первых, трофико-хорологическими условиями – D. reticulatus тяготеет к открытым опушечным участкам леса, где в начале весны наблюдается наиболее высокая активность диких копытных. Для исследуемой территории это 4 вида копытных: кабан, косуля, лось и олень, которые являются основными прокормителями имаго D. reticulatus. Во-вторых, возможными конкурентными отношениями между этими видами иксодовых клещей. Во всяком случае, в периоды их высокой активности (численности), отмеченной в апреле, подобные взаимоотношения реально могут складываться и доминантом здесь, по-видимому, является D. reticulatus.

Выявлена прямая зависимость между активностью клещей и атмосферными факторами. Уровни корреляции (r) изменяются в течение сезона активности клещей от 0,4 до 0,7. Весной отмечена наиболее тесная зависимость (r=0,7; p<0,01) активности клещей с температурой и влажностью. Максимум активности зарегистрирован при температуре воздуха от +17 до +20°С и влажности свыше 50%. При повышении температуры воздуха свыше +25°С и влажности менее 50% наблюдали снижение активности клещей.

Выборка I. ricinus исследована методом ПЦР на наличие боррелий. По результатам анализа содержимого кишечника от 97 клещей, собранных в Воронежском заповеднике на различных маршрутах, положительный сигнал на присутствие ДНК OspA гена боррелий B. burgdorferi s.l. был зафиксирован в 25 образцах, что составляет 25,8%. Видовой состав боррелий (группа B. burgdorferi s.s.), циркулирующих на исследуемой территории, представлен видами: B. afzelii и B. garinii. В содержимом кишечника одного клеща была диагностирована микстинфекция, обнаружена ДНК обоих видов боррелий. Одновременно у данной выборки I. ricinus проведена диагностика возбудителя ГЭЧ (Anaplasma phagocytophilum), получен отрицательный результат. При сравнении данных по зараженности клещей боррелиями на различных маршрутах установлено, что наиболее высокие показатели (36,0%) отмечены в экологических стациях, расположенных вблизи жилья человека (Центральная усадьба Воронежского заповедника). В этой связи указанная территория может быть определена как зона наиболее высокого эпидемиологического и эпизоотологического рисков в отношении ИКБ. Выявлены существенные различия по встречаемости боррелий в связи с полом I. ricinus. Так обсемененность боррелиями самок клещей составила 38,5%, что в 2 раза выше обсемененности самцов (17,1%).

На исследуемой территории собаки, наряду с дикими хищниками, являются важной экологической группой из числа прокормителей иксодовых клещей. Следовательно, они подвержены высокому риску инфицирования боррелиями. Анамнестические данные указывают, что все собаки имели или имеют в различной мере контакты с лесным массивом заповедника. Обследованию подвергнуты собаки из 21 населенного пункта (Центральная усадьба заповедника, кордоны, некоторые близлежащие поселки и деревни). На основании серологических исследований крови боррелиоз диагностирован у 15 из 82 собак (18,3%). По данным тестирования у зараженных и иммунных животных титры антител в сыворотке крови варьировали от 1,031 до 2,532. При этом среди положительно реагирующих собак большая часть (40%) диагностирована в районе Центральной усадьбы заповедника. Здесь же, как было показано выше, зарегистрирована и самая высокая обсемененность I. ricinus боррелиями. Можно предположить, что домашние собаки вносят определенный (возможно существенный) вклад в циркуляцию ИКБ в условиях природных экосистем.

Таким образом, по результатам настоящих исследований, проведенных в Воронежском заповеднике, можно констатировать, что на территории Воронежской области (Воронежский заповедник) устойчиво функционирует природный очаг ИКБ. Выявлено два вида возбудителей болезни Лайма – B. afzelii и B. garinii. Переносчиком и резервентом боррелий является I. ricinus, зараженность которых на исследуемой территории составляет 25,8%. Вблизи населенных пунктов наблюдается увеличение встречаемости боррелий в клещах. Численность иксодесов в теплое время года (данные 2008 г.) выявлена в среднем на уровне 2,2 экз. на флаго/км. Отмечена сравнительно высокая зараженность домашних собак боррелиями (18,3%).

Summary
Romashova   N.B.1,   Pustovit   N.S.2,   Shtannikov   A.V.3,   Trankvilevsky   D.V.4,   Romashov   B.V.1 Ecological and epizootic aspects Lyme disease of natural center in Voronezh region. Voronezh biosphere reserve1, Veterinary clinic “Center”2, State research center for applied microbiology and biotechnology3, Center of hygiene and epidemiology in Voronezh region4
In Voronezh region registered on the natural center of Lyme disease. It is revealed two species agents of Lyme disease – B. afzelii and B. garinii. Infection by borreliae of ticks (I. ricinus) is 25,8%. Infection by borreliae of dogs is 18,3%.