Оптимизация режимов лазерного термического воздействия для стимуляции процессов апоптоза при онкологических заболеваниях у мелких домашних животных
Терентюк Г.С. (1,2,3), Трояновская Л.П. (1), Соболева Е.П. (1), Акчурин Г.Г (3), Максимова И.Л. (3) ., Сулейманова Л.В. (4)
(1) Воронежский аграрный университет, г. Воронеж,
(2) Первая ветеринарная клиника, г. Саратов,
(3) Саратовский государственный университет, г. Саратов,
(4) Саратовский государственный медицинский университет, г. Саратов
Источник: материалы XVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных.
В работе представлены результаты применения излучения полупроводникового лазера с длиной волны 0.81 мкм для гипертермии злокачественных новообразований кожи и слизистых оболочек мелких домашних животных. Хирургический способ лечения злокачественных новообразований кожи наружного слухового прохода и слизистых оболочек полости рта является высокотравматичным, а в ряде случаев невозможным из-за труднодоступности и большого риска травмирования жизненно важных органов. В связи с этим особый интерес вызывают альтернативные методы, и, в частности, лазерная гипертермия. Для эффективного применения данного метода необходим оптимальный выбор длины волны излучения, плотности оптической мощности и режима облучения. Особое внимание уделено режимам воздействия, не приводящим к выраженному некрозу тканей, но вызывающим повышение температуры и другие изменения биоткани, которые могут стимулировать процессы апоптоза. Наиболее четко морфологические признаки апоптоза выявляются при электронной микроскопии.
В ветеринарной онкологии опыт использования лазеров не столь значительный, как в гуманитарной медицине. Вместе с тем результаты, полученные при лазерном лечении спонтанных опухолей у животных могут лечь в основу разработки новых перспективных методик. Лазерным методикам присущи высокая точность манипуляции, позволяющая избежать повреждения соседних структур, быстрое и бескровное проведение хирургических вмешательств, минимальная реакция окружающих тканей на лазерное воздействие, отсутствие интенсивной воспалительной реакции в краевой зоне операционной раны, что способствует процессам быстрой и полноценной регенерации, предупреждению грубой рубцовой деформации. Кроме того, абластичность лазерного излучения предупреждает диссеминацию опухолевых клеток, обладающих инвазивным ростом, что особенно важно при лечении рака начальных стадий.
Целью данной работы является оценка возможностей использования лазерного излучения в ближней ИК области для гипертермии новообразований и выбор оптимальных параметров лазерного воздействия.
Для неинвазивного контроля температуры в области локализации опухоли используется инфракрасная термография. Тепловое воздействие лазерного излучения на биоткани основывается на поглощении излучения и преобразовании его энергии в тепло. Эффект зависит как от температуры, так и от длительности воздействия. При температуре до 450С градусов не ожидается каких-либо необратимых повреждений ткани. При температуре около 600С достаточно быстро наступает денатурация белков. Она может быть полной или частичной, обратимой или необратимой. Во многом степень денатурации белков зависит от времени воздействия. Скорость денатурации для различных белковых структур может сильно отличаться друг от друга. В реальных условиях критическая температура начала денатурации большинства тканевых компонент составляет около 570С.
Заметное обезвоживание биологических тканей начинается при температуре около 700С. При достижении температуры кипения воды происходит обезвоживание ткани, поскольку внутритканевая вода превращается в пар, при этом создается значительное избыточное давление. При медленном нагреве образующийся пар успевает выйти из объема биоткани через множество пор. Которые в ней обычно имеются или образуются под напором пара и в результате термической деструкции матрикса. Такой процесс называют фотовыпариванием. Скорость нагрева ткани вблизи 1000С существенно уменьшается из-за значительных затрат энергии на парообразование. После ухода воды высушенная ткань быстро нагревается до 1500С, при которой начинается процесс карбонизации. При карбонизации из органических молекул выходит водород и образуется мелкодисперсный углерод (сажа), то есть происходит обугливание. При температуре выше 3000С испаряется органический матрикс ткани.
Диагностическая инфракрасная термография широко применяется в клинической онкологии. Известно, что термографическое изображение злокачественной опухоли, как правило, превышает визуально определяемые границы новообразования, что обусловило введение понятия “опухолевое поле” - зона между периметрами термографического и визуального изображения опухоли. Ориентация на опухолевое поле позволяет более адекватно планировать объем хирургического вмешательства. Для неинвазивного контроля температуры в работе использовался инфракрасный тепловизор IRISYS 4010 (UK).
Тепловизор IRISYS 4010 имеет неохлаждаемую болометрическую матрицу, что делает его более удобным для применения в ветеринарных клиниках, по сравнению с тепловизорами, охлаждаемыми жидким азотом. Для объективного контроля температуры при лазерном воздействии на опухоли необходимо, чтобы на результаты тепловизионных измерений не влияло рассеянное лазерное излучение. Выполнение данного условия вполне обеспечивается, так как диапазон длин волн, воспринимаемых тепловизором IRISYS 4010, составляет: 8-14 мкм, а длина волны используемого в данной работе полупроводникового лазера 0.81 мкм.
При проведении экспериментальных исследований с белыми лабораторными крысами животным проводилась общая анестезия. Проведение исследований осуществлялось согласно протоколу исследований, утвержденному Комитетом по этике ГОУ ВПО СГМУ (протокол №13 от 10 апреля 2007 г.) и не противоречат Женевской Конвенции 1985 года о “Интернациональных принципах биомедицинских исследований с использованием животных”.
В работе проведено сопоставление возникающих в биоткани изменений, определяемых методами гистологического анализа, с термограммами, измеренными на поверхности локальных участков биоткани in vivo непосредственно после лазерного воздействия. Экспериментальные животные фиксировались в горизонтальном положении на спине, живот был выбрит от диафрагмы до лонного сочленения. Исследуемые участки кожи маркировались симметрично средней линии живота. Анализируются различные режимы лазерного облучения (разная мощность и длительность облучения, непрерывный и импульсный режимы воздействия). Проведена серия экспериментальных измерений термограмм при различной длительности лазерного воздействия. При лазерном воздействии длительностью до 10 секунд визуальных изменений не наблюдалось, при длительности воздействия более 30 секунд на поверхности кожи отмечается появление бледного ожогового пятна. Контроль пространственного распределения температуры поверхности кожи с помощью тепловизора показал, что через 10 секунд лазерного воздействия максимальная темпера в центре лазерного пятна составляет около 45 градусов. Более длительное воздействие (30 секунд) лазерного излучения приводит к незначительному повышению максимальной температуры (до 46 градусов), но при этом существенно увеличивается размер нагретой области за счет эффектов тепловой диффузии. При таких температурах не ожидается каких-либо необратимых повреждений ткани (лишь при достаточно длительном нагреве может произойти гибель клеток). Диаметр пятна, в котором температура превышает нормальную температуру поверхности кожи крысы, за 30 секунд лазерного воздействия увеличивается в 2-3 раза по сравнению с диаметром при 10 секундном облучении.
Гистологические исследования свидетельствуют о следующих изменениях в тканях животных при длительности воздействия 10 сек. Эпидермис сохранен на всем протяжении. В дерме отек с разволокнением и беспорядочным расположением волокон, отек стромы. В мышцах поперечная исчерченность отсутствует. В глубоко лежащих мышцах ядра сохранены. В подлежащих слоях дермы резкий склероз, имеются прослойки грануляционной ткани с большим количеством полнокровных сосудов, которые прорастают между мышцами. Наблюдаются также изменения в тканях, которые при продолжительности жизни животного более двух суток приводят к развитию молодой соединительной ткани.
По результатам гистологического исследования после лазерного воздействия длительностью 30 секунд - эпидермис отсутствует. В дерме резко выраженное полнокровие, кровоизлияния, резкий деструктивный отек. Имеются участки с неизмененным эпидермисом, в подкожной дерме резкий склероз, на некоторых участках эпидермис резко утолщен, к базальному слою прилегает резко выраженная лейкоцитарная инфильтрация, в самом эпидермисе клетки не сохранены, глыбчатый распад ядер (некроз). Мышечные волокна располагаются отдельными фрагментами, поперечная исчерченность не определяется. На отдельных участках в строме между фрагментами мышц выражена клеточная инфильтрация с преобладанием лейкоцитов. Таким образом, в результате значительного повышения температуры в зоне воздействия развиваются выраженные изменения. Кроме того, они распространяются также на глубоко расположенные ткани.
Во всех случаях лазерной гипертермии спонтанных опухолей у животных лазерному воздействию предшествовало тщательное обследование, которое включало общеклиническое, лабораторное, морфологическое исследования биопсийного материала, ультразвуковое исследование и рентген грудной клетки. Для уточняющей диагностики опухолевого поля злокачественных новообразований использовалась инфракрасная термография. Основная доля энергии лазерного излучения поглощалась содержащимися в опухоли пигментами, что приводило к резкому локальному повышению температуры. Неинвазивный контроль локальности гипертермии и температуры опухолевых тканей при лазерном воздействии осуществлялся с помощью инфракрасного термографа.
Лазерная гипертермия применялась при следующих злокачественных новообразованиях кожи и слизистой рта: плоскоклеточный неороговевающий рак кожи наружного слухового прохода (8 собак), плоскоклеточный рак слизистой оболочки рта (14 собак), базалиома (19 собак).
Использовался полупроводниковый лазер OPTO POWER CORPORATION с длиной волны 0.81 мкм. Воздействие проводилось при непрерывном и импульсном режимах (длительность 2 мс, скважность 7) работы лазера при выходной мощности 2 Вт. Для направленного воздействия на опухоль использовался многомодовый оптоволоконный световод с угловой расходимостью 15 градусов. Расстояние от торца волоконного световода до поверхности опухоли составляло около 2 см. Длительность облучения составляла от 3 до 15 минут в зависимости от размера опухоли. Для визуального контроля области воздействия невидимого инфракрасного излучения использовался компьютерный мониторинг с помощью веб-камеры. Для защиты глаз хирурга применялись защитные очки фирмы Palomar с оптической плотностью >7 на длине волны 0.8 мкм.
Поскольку размер пятна лазерного излучения в большинстве случаев был меньше размера опухоли, для равномерного нагрева последней облучаемая область непрерывно смещалась по опухоли с помощью волоконно-оптического манипулятора. Предположительно, основная доля энергии лазерного излучения поглощалась содержащимися в опухоли пигментами, что приводило к резкому локальному повышению температуры и обугливанию ткани. Вследствие неоднородного распределения поглощающих центров, при смещении лазерного пятна по поверхности опухоли нагрев происходил неравномерно и в отдельных участках, предположительно соответствующих максимальному скоплению пигмента, очень быстро происходила коагуляция тканей. Облучение в импульсном режиме проводилось без анестезии, так как при лазерном импульсном воздействии локальная температура не превышала 43-45 С, что контролировалось в реальном времени с помощью тепловизора. Такая локальная температура не вызывала возбуждения болевых нейронов у животного.
Для определения степени развития апоптоза в тканях до и после лазерного воздействия проводились иммуноцитохимические и иммуногистохимические исследования с использованием маркера BCL-2. на основании полученных результатов можно сделать вывод, что маркер BCL-2 лучше использовать при лимфопролиферативных процессах или для определения перифокального воспаления, обусловленного лазерным термическим воздействием или самим онкологическим процессом. В дальнейшем планируется использовать BCL-2 в комплексе с другими маркерами для повышения диагностической эффективности.
При импульсном лазерном воздействии удается достичь регрессии опухоли до 70 % без некротизации тканей. При непрерывном режиме через одну неделю после лазерного воздействия обычно наблюдалась воспалительная реакция средней степени. Эпителизация наступала на 12-15 сутки. В 80% случаев ремисся составляет от 6 до 11 месяцев. Показана перспективность использования лазерного излучения ближней ИК области для фототермолиза труднодоступных опухолей кожи и слизистых оболочек. Абсолютная безвредность термографии позволяет применять её многократно, наблюдать процессы в динамике. Интерпретация термограмм в настоящее время представляет довольно сложную задачу, и создание атласа термографии мелких животных значительно облегчило бы её.
Summary
Terentyuk G.S., Тroyanovskaya L.P., Soboleva E.P., Akchurin G.G., Maksimova I.L., Suleymanova L.V., Optimization of laser thermal action regimes for apoptosis stimulation by cancer of small animals. Voronez State University, Voronez, Russia, The First Veterinary Clinic, Saratov, Russia, Saratov State University, Saratov, Russia, Saratov Medical State University, Saratov, Russia
This paper deals with the problem of using semiconductor laser radiation (wave length 810 nm) for healing skin and mucous cancer of small animal. Opportunities of using different types of lasers for clinical applications under oncological diseases of skin and oral mucous have been analyzed. We determined power densities and duration of laser irradiation for different types of tumors. IR thermograph was used for noninvasive temperature monitoring in the area of tumor localization. For noninvasive measuring and registration of spatial distribution of radiation temperature of investigated objects, we used IR Imager IRISYS 4010 Infrared Integrated System Ltd (UK).