Кожевникова Т.Н., Ожерелков С.В., Куприянов В.В.,Васильев И.К., , Наровлянский А.Н., Пронин А.В., Санин А.В.
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, Москва

Проблема профилактики стресса у животных продолжает оставаться актуальной. Количество физиологических и психоэмоциональных стресс-факторов, воздействующих на животных, в современных условиях постоянно возрастает (1). Это обстоятельство приводит к развитию в организме вторичных иммунодефицитов, что в свою очередь осложняет течение заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, снижает иммунный ответ при вакцинации, а также может сопровождаться развитием иммунопатологических реакций и поствакцинальных осложнений (6). В связи вышеизложенным, актуальным представляется поиск и правильное применение препаратов – иммунокорректоров и адаптогенов. Широко применяемые в ветеринарной практике иммуномодуляторы Фоспренил и Гамавит хорошо зарекомендовали себя также в качестве профилактических антистрессорных препаратов и адаптогенов (1,3,4,5). С целью более подробного изучения механизмов антистрессорных свойств препарата Фоспренил (ФП) мы исследовали его способность предотвращать стресс-индуцированные нарушения функций иммунокомпетентных клеток в условиях эксперимента. В качестве модели использовали перевиваемую линию клеток макрофагов мышей P388D1. Выбор данной линии клеток представлялся оптимальным, так как клетки P388D1 в норме обладают способностью синтезировать и продуцировать целый ряд интерлейкинов (ИЛ), необходимых для регуляции и формирования оптимального иммунного ответа при вирусных и бактериальных инфекциях: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, фактор ингибиции миграции (МИФ), интерферон-α (ИФН-α). При этом хорошо известно, что стресс-индуцированный иммунодефицит характеризуется, в частности, нарушениями способности иммунокомпетентных клеток к синтезу и продукции иммунорегуляторных ИЛ (6).

В настоящей работе изучали антистрессорную эффективность ФП, препарата Гамапрен (ГП) - фосфорилированного полипренола, выделенного из шелковицы и отличающегося от ФП не только происхождением (полипренолы для фоспренила выделяют из хвои), но и структурой, а также препарата Ридостин, являющегося стандартным индуктором ИФН-α. Проводили определение м-РНК МИФ и ИФН-α μетодом ОТ-ПЦР.

Исследования проводились на перевиваемой культуре клеток макрофагов мышей Р388 D1, выращиваемых в среде RPMI 1640 c 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки обрабатывали препаратами: ФП (серии № 104 производства ЗАО “Микро-плюс”) в дозе 200 мкг/мл, ГП (серии № 0003 производства ОАО "ГамаВетФарм") в дозе 200мкг/мл иРидостином производства ЗАО "Вектор-Медика", Кольцово, серии №50605 в дозах 100 и 300мкг/мл. Клетки заражали вирусом клещевого энцефалита ВКЭ, штамм Софьин (исходный титр вируса -8 lgБОЕ50) в дозе - 10 БОЕ/кл. Выделение РНК проводили с использованием наборов фирмы Promega (SV Total RNA Isolation System). Обратную транскрипцию проводили с обратной транскриптазой M-MulV (RNaseH-) фирмы "Сибэнзим", используя в качестве праймера олиго-дТ при 37оС 60 минут и ПЦР с Таq-полимеразным комплексом с моноклональными антителами фирмы ИМТЕК.

Стрессовую ситуацию для клеток создавали при помощи замены питательной среды на физиологический раствор (ФР), что, является стресс-фактором для клеток (7). Для выявления антистрессорных свойств препаратов в ФР добавляли препараты в вышеуказанных концентрациях. Через 2 часа воздействия стресс-фактора проводили определение мРНК МИФ и ИФН-α методом ОТ-ПЦР. Данные, представленные на Рис.1, показывают, что инкубация клеток в ФР приводит к резкому снижению синтеза мРНК МИФ; при этом ФП и Ридостин проявили свойства адаптогена, позволившие сохранить синтез мРНК МИФ на прежнем уровне. В то же время мРНК ИФН-α βыявлялась только в присутствии Ридостина, причем в значительном количестве, что свидетельствует об её индукции в данных условиях. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при стрессе в клетках существенно подавляется синтез мРНК МИФ и ИФН-α, а ФП и Ридостин обладают способностью корректировать стресс-индуцированное подавление синтеза мРНК МИФ в клетках Р388 D1.

Рис. 1. Коррекция Фоспренилом и Ридостином стресс-индуцированного подавления синтеза м-РНК
МИФ через 2 часа инкубации клеток в физиологическом растворе.

300нт

      1     2     3       4      5        6       7       8       9       10       11

1-маркеры, 2-негативный контроль, 3-позитивный контроль, 4-необработанные клетки,
5-клетки+ФП, 6-клетки+ГП, 7-клетки+ВКЭ, 8-клетки+ВКЭ+ФП, 9-клетки+ВКЭ+ГП,
10-клетки+ридостин(100мкгмл), 11-клетки+ридостин(300мкгмл)


Рис.2. Коррекция Ридостином стресс-индуцированного подавления синтеза м-РНК ИНФ-α через
2часа инкубации клеток в физиологическом растворе.

500нт

      1            2            3            4            5            6            7            8            9

1-маркеры, 2-негативный контроль, 3-необработанные клетки, 4-клетки+ФП, 5-клетки+ГП,
6-клетки+ВКЭ, 7-клетки+ВКЭ+ФП, 8-клетки+ВКЭ+ГП, 9-клетки+ридостин(300мкгмл)

Таким образом, полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что ФП обладает способностью предотвращать стресс-индуцированное нарушение способности иммунокомпетентных клеток синтезировать ЦТ, необходимые для формирования и регуляции адекватного иммунного ответа при инфекционном процессе (2). Выявленные в данной работе свойства ФП, с одной стороны, подтверждают полученные ранее экспериментальные и клинические данные о перспективности использования ФП в качестве иммунокорректора и адаптогена, а с другой – обосновывают сочетанное применение ФП с другими известными иммунокорректорами, например, с Гамавитом и Ридостином (4).

Литература

1. Санин А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных. "Российский журнал ветеринарной медицины", №1, 2005, с. 38-42
2. Пронин А.В. и соавт. (Pronin A.V., Ozherelkov S.V., Narovlyansky A.N. et al.) Role of cytokines in immunomodulating effects of polyprenol phosphate, new generation of antiviral drugs. Russ. J. Immunol, 2000, 5: 156-164.
3. Деева А.В., Ожерелков С.В., Жукова С.Л. и др. Фоспренил – противовирусный препарат широкого спектра действия. Ветеринарная практика. 1998, 3: 4-12.
4. Никитин О.А. Терапевтическая эффективность гамавита при лечении мелких домашних животных. Зооиндустрия, 2003,N5, с.28.
5. Деева А.В. Зайцева М.Л. Андреева М.В. “ Путешествуем без стресса”. Конный мир №3, 2005.
6. Селье Г. Стресс без дистресса. М., Прогресс, 1979.
7. Сапин М.Р., Никитюк Д.Б. Иммунная система, стресс и иммунодефицит.– М., АПП “Джангар”. – 2000. – С. 104–174.

Summary
Kozhevnikova T.N., Ozherelkov S.V., Kupriyanov V.V., Vasiliev I.K., Narovlyansky A.N., Pronin A.V., Sanin A.V.: on the usage of immunomodulators and adaptogens for preventive care of stress in animals.
N.F.Gamaleya Institute for Epidemiology and Microbiology, M.P.Chumakov Institute of poliomyelitis and viral encephalitis, Moscow, Russia
Experimental study was made to assess effect of known immunomodulator Phosprenyl upon in vitro induced stress reaction in P388D1 cells of macrophage origin. Phosprenyl was found to prevent stress-induced inhibition of macrophage migration inhibitory factor (MIF) mRNA synthesis.

Источник: материалы Московского международного ветеринарного конгресса